Tempat dan waktu penelitian Materi penelitian

BAB II BAHAN DAN METODE

A. Tempat dan waktu penelitian

Penelitian ini dilakukan di rumah kaca dan Laboratorium Rekayasa Genetik Biomolekuler, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia BPBPI, Bogor dan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Jurusan Biologi FMIPA, Institut Pertanian Bogor. Seluruh kegiatan penelitian dilaksanakan dari bulan Juli 2003 sampai Mei 2006. Penelitian ini terdiri dari lima percobaan, yaitu : 1. Pengembangan teknologi akar rambut beberapa tanaman secara in vitro 2. Perbanyakan G. margarita dan A. tuberculata dengan kultur pot di rumah kaca 3. Penyediaan inokulum steril G. margarita dan A. tuberculata dalam kultur aksenik dengan eksplan tomat dan wortel 4. Perkembangan G. margarita dan A. tuberculata secara in vitro menggunakan teknologi akar rambut wortel 5. Teknologi enkapsulasi untuk pengemasan G. margarita dan A. tuberculata dengan Na-alginat Bahan dan metode percobaan diuraikan secara lengkap pada masing- masing percobaan. Alur penelitian yang menunjukkan keterkaitan antar percobaan disajikan dalam Gambar 1.

B. Materi penelitian

Materi penelitian secara keseluruhan digunakan beberapa bahan, yang dikelompokkan ke dalam satu sampai lima subtopik penelitian, sebagai berikut : Penelitian I . Untuk seleksi akar rambut digunakan lima jenis tanaman terdiri dari monokotil dan dikotil. Monokotil terdiri dari dua jenis yaitu sorghum dan jagung. Dikotil terdiri dari tiga jenis yaitu kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel, yang diinokulasi dengan A. rhizogenes galur LBA 9457 koleksi BPBPI. Media yang digunakan adalah MS, B5, White dan kultur ganda MM dari Becard Fortin 1988. Primer yang digunakan adalah TL Primer TL-DNA rol B1 5’atggatcccaaattgctattccccacga3’, dan rolB2 ’ttaggcttctttcattcgggtttactgcagc3’. Primer TR-DNA TR1 : 5’ggaaattgtggctcgttgtggac3’ TR2: 5’aatcgttcagagagcgtccgaagtt3’. Penelitian II. Digunakan tempat tumbuh cawan Petri plastik dan gelas plastik warna dengan media tumbuh zeolit, tanaman sorghum dan Pueraria phaseoloides.L. sebagai inang untuk perbanyakan spora G. margarita koleksi BPBPI dan A. tuberculata koleksi PT. Intidaya Agrolestari Inagro, yang diperbanyak di rumah kaca, dan digunakan sebagai sumber spora steril untuk penelitian III dan V. Penelitian III . Sumber spora diperoleh dari penelitian II. Digunakan tiga macam sterilisasi, yaitu menurut Buce et al. 2000 sebagai sterilisasi 1, Chabot 1992 sebagai sterilisasi 2, menurut Declerck et al. 1998 sebagai sterilisasi 3 Lampiran 9, dan dua jenis cendawan mikorhiza arbuscula CMA yaitu G. margarita dan A. tuberculata. Tanaman inang digunakan eksplan tomat dan wortel, medium kultur ganda yang digunakan terdiri dari dua macam yaitu medium MM Becard Fortin, 1988 dan MSR Strullu Romand 1986 Lampiran 1A. Penelitian IV. Sumber inokulum steril G. margarita dan A. tuberculata diperoleh dari penelitian III, dengan inang akar rambut diperoleh dari penelitian I, dipilih akar rambut yang mampu tumbuh baik pada medium kultur ganda, mempunyai percabangan akar banyak dan tidak terpengaruh dengan subkultur. Penelitian V. Digunakan Na-alginat sebagai bahan enkapsulasi G. margarita dan A. tuberculata, serta larutan CaCl 2 5 , sebagai bahan pembeku Na-alginat. Gambar 1. Alur penelitian “Pemanfaatan teknologi in vitro untuk perkembangan spora G. margarita dan A. tuberculata”. Percobaan 1 Pengembangan teknologi akar rambut beberapa tanaman secara in vitro Output: • Tanaman yang merespons T-DNA A.rhizogenes membentuk akar rambut • Mendapatkan medium optimal untuk pertumbuhan akar rambut • Mendapatkan akar rambut yang tumbuh kembang paling baik pada kultur ganda Percobaan 3 Penyediaan inokulum steril Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata di dalam kultur aksenik dengan eksplan tomat dan wortel Output: • Mendapatkan spora, dan propagul sebagai inokulum steril. • Mengetahui pengaruh tanaman dan media, terhadap persediaan inokulum steril. • Mendapatkan teknis sterilisasi spora yang optimal Output penelitian • Inang terbaik untuk perbanyakan CMA secara in vitro • Mendapatkan inang yang kompatibel, dan metode untuk perbanyakan spora CMA secara konvensional di rumah kaca • Mendapatkan teknik perbanyakan spora CMA steril secara in vitro dengan kultur aksenik maupun dengan kultur ganda • Mendapatkan teknik enkapsulasi spora CMA Percobaan 2 Perbanyakan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata kultur pot di rumah kaca Output : ? Tanaman inang yang kompatibel ? Tempat tumbuhan yang tepat untuk perbanyakan inokulum CMA secara optimal Percobaan 4 Perkembangan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata secara in vitro menggunakan teknologi akar rambut wortel Output: • Media kultur ganda terbaik untuk pertumbuhan CMA • Mengetahui pola pertumbuhan akar rambut yang diinokulasi dan yang tidak diinokulasi CMA Percobaan 5 Teknologi pengemasan Na-alginat spora CMA Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata Output: • Teknik pengemasan spora CMA dengan Na-alginat BAB III TINJAUAN PUSTAKA Pemanfaatan teknologi in vitro merupakan salah satu upaya peningkatan kualitas produksi cendawan mikorhiza arbuskula CMA. Teknologi in vitro adalah teknologi perkembangan mikroorganisme steril dalam laboratorium, dengan media khusus dikond usifkan untuk pertumbuhannya Sarin 1996, Yatim 1999. Kultur aksenik adalah biakan mikroorganisme steril dan murni Abercrombie et al. 1993, Anonimus 2006 a. Beberapa aspek diuraikan guna mendukung penelitian pemanfaatan teknologi in vitro untuk perkembangan spora Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata, yaitu aspek teknologi akar rambut oleh Agrobacterium rhizogenes, aspek perkembangan CMA kultur pot dan kultur aksenik CMA in vitro, serta enkapsulasi spora. A . Agrobacterium rhizogenes A.1. Karakteristik A. rhizogenes.

A. rhizogenes bakteri Gram negatif termasuk dalam kelompok

Rhizobiaceae, hidup di tanah, bersifat aerobik, tidak membentuk spora, motil dan berbentuk batang. Agrobacterium dapat mentransfer T-DNA ke dalam genom tanaman. DNA terintegrasi stabil pada kromosom tanaman dan mampu mengubah susunan genetik tanaman, diturunkan ke sel anak dan ekspresi gen T- DNA menimbulkan penyakit akar rambut. T-DNA berukuran sekitar 15-30 kb dan memiliki beberapa gen Twyman 1998. T-DNA terdiri dua bagian yaitu TL dan TR. TR-DNA mengandung gen untuk biosintesis auksin dan membawa gen penyandi sintesis opin, yaitu asam amino derivatif yang tidak ditemukan dalam jaringan normal. Opin dimanfaatkan oleh Agrobacterium sebagai sumber karbon dan nitrogen Lebowitz 1995. TL- DNA mengkode satu set gen lokus, yaitu gen rol A, rol B dan ro1 C. Daerah TL- DNA lebih penting menginduksi akar rambut karena gen tersebut menginduksi akar, dan berperan terhadap fenotip akar. Gen TL-DNA selalu ditemukan dalam akar transformasi, sedang gen TR-DNA mengkode biosintesis opin dan auksin meskipun tidak selalu ditemukan Nasir 2002. Gambar 2. Plasmid Ri Jacobsen 2004 A.2. Transformasi gen oleh A. rhizogenes Sheng Citovsky 1996 menyatakan bahwa tiga komponen genetik harus dimiliki oleh Agrobacterium untuk melaksanakan transfer T-DNA yaitu: 1 T-DNA ditransfer ke tanaman, 2 berbagai gen virulensi vir terdiri atas vir A, vir B, vir D dan vir G berfungsi untuk proses terjadinya transfer T-DNA dari bakteri ke tanaman, vir C dan vir E meningkatkan efisiensi transfer T-DNA ke sel tanaman dan, 3 beberapa gen pada kromosom Agrobacterium yaitu Chromosomal virulence chv terdiri dari chv A dan chv B, sebagai penyandi enzim untuk sintesis dan ekspresi β -1,2 glukan dari sel Agrobacterium berfungsi untuk pelekatan bakteri ke dalam sel tanaman. Gelvin 2000 menyatakan sedikitnya terdapat tujuh langkah dalam proses transfer molekul T-DNA sel Agrobacterium ke sel tanaman yaitu : 1 pengenalan sel tanaman rentan, 2 induksi ekspresi gen vir, 3 kopi T-DNA yang ditransfer, 4 transfer kompleks T-DNA ke dalam membran bakteri, 5 transfer kompleks T- DNA membran bakteri ke sitoplasma tanaman, 6 tranfer kompleks T-DNA sitoplasma tanaman ke membran inti, dan 7 integrasi T-DNA ke dalam genom inti tanaman Zambryski 1998. Proses transfer T-DNA sel Agrobacterium ke sel tanaman Gambar 3 Winans 1992 menyatakan bahwa proses inisiasi transfer T-DNA diawali pengenalan Agrobacterium terhadap sel tanaman luka. Interaksi ini merupakan