rhizogenes bakteri Gram negatif termasuk dalam kelompok
akar transformasi, sedang gen TR-DNA mengkode biosintesis opin dan auksin meskipun tidak selalu ditemukan Nasir 2002.
Gambar 2. Plasmid Ri Jacobsen 2004
A.2. Transformasi gen oleh A. rhizogenes
Sheng Citovsky 1996 menyatakan bahwa tiga komponen genetik harus dimiliki oleh
Agrobacterium untuk melaksanakan transfer T-DNA yaitu: 1 T-DNA ditransfer ke tanaman, 2 berbagai gen virulensi
vir terdiri atas vir A, vir B, vir D dan vir G berfungsi untuk proses terjadinya transfer T-DNA dari bakteri
ke tanaman, vir C dan vir E meningkatkan efisiensi transfer T-DNA ke sel
tanaman dan, 3 beberapa gen pada kromosom Agrobacterium yaitu
Chromosomal virulence chv terdiri dari chv A dan chv B, sebagai penyandi enzim untuk sintesis dan ekspresi
β -1,2 glukan dari sel
Agrobacterium berfungsi untuk pelekatan bakteri ke dalam sel tanaman.
Gelvin 2000 menyatakan sedikitnya terdapat tujuh langkah dalam proses transfer molekul T-DNA sel
Agrobacterium ke sel tanaman yaitu : 1 pengenalan sel tanaman rentan, 2 induksi ekspresi gen
vir, 3 kopi T-DNA yang ditransfer, 4 transfer kompleks T-DNA ke dalam membran bakteri, 5 transfer kompleks T-
DNA membran bakteri ke sitoplasma tanaman, 6 tranfer kompleks T-DNA sitoplasma tanaman ke membran inti, dan 7 integrasi T-DNA ke dalam genom
inti tanaman Zambryski 1998. Proses transfer T-DNA sel Agrobacterium ke sel
tanaman Gambar 3 Winans 1992 menyatakan bahwa proses inisiasi transfer T-DNA diawali
pengenalan Agrobacterium terhadap sel tanaman luka. Interaksi ini merupakan
respons kemotaksis terhadap metabolit, dikeluarkan oleh sel tanaman luka berupa monosiklik fenolik seperti
asetosiringon dan monosakarida seperti glukosa dan galaktosa, dan
Agrobacterium akan bergerak aktif menuju sel tanaman. T-DNA ditransfer lebih dari satu molekul T-DNA, situs integrasi T-DNA pada
kromosom tanaman bersifat acak, dan T-DNA akan terintegrasi stabil pada kromosom tanaman Giri Narasu 2000.
Senyawa metabolit dikeluarkan oleh sel tanaman luka, berfungsi sebagai inducer mengaktifkan gen vir. Senyawa gula dan pH bersifat asam merupakan
faktor penting dalam proses induksi gen vir, di samping senyawa asetosiringon
Baron Zambryski 1995. Mekanisme selanjutnya induksi faktor vir mengatur
pemotongan dan pemindahan T-DNA ke dalam sel tanaman. Faktor vir terinduksi
akibat senyawa fenol yang dikeluarkan oleh tanaman yang dilukai. Beberapa senyawa fenol dapat menginduksi faktor
vir yaitu asetosiringon, hidroksi asetosiringon, konifenil alkohol, koniferin feniproponoid glukosida dan etil
firulat Winans 1992. Apabila asetosiringon tidak diproduksi, monosakarida seperti glukosa, galaktosa, arabinosa, fruktosa dan silosa menginduksi faktor
vir Cangelosi
et al. 1989. Terdapat enam faktor virulens diketahui berfungsi untuk proses pemindahan T-DNA, yaitu
vir A, vir B, vir C, vir D, vir E dan vir G. Senyawa fenolik dikeluarkan menginduksi
vir A memproduksi suatu protein
vir A. Protein vir A mengalami autofosforilasi dan menginduksi fosforilasi protein
vir G. Selanjutnya potein vir G mengaktifkan gen vir lain. Produk berupa protein
vir D1, dan vir D2 memotong T-DNA pada daerah flanking daerah susunan DNA berulang
. Daerah tersebut sebagai pembatas kiri left border dan pembatas kanan
right border T-DNA. Komponen pembatas kanan mutlak diperlukan dalam transfer T-DNA
. Adanya pemotongan gen vir D menyebabkan terbentuk molekul DNA utas tunggal ss-DNA atau disebut
T-strand. Struktur T-strand ditransfer sel Agrobacterium ke sel tanaman berupa DNA-protein
kompleks Powell et al. 1989.
Transportasi kompleks T-DNA ke sel tanaman dibantu oleh vir D4, 11
protein vir B dan hidrolisis ATP. Protein vir B akan membentuk pori trans
membran yang berhubungan dengan sel tanaman. vir D2 dan vir E2
memungkinkan masuknya kompleks T-DNA ke inti sel melalui nuclear pore
complex NPC. T-DNA berintegrasi dengan genom tanaman dan ekspresi gen membentuk opin dan hormon pertumbuhan menyebabkan terjadinya proliferasi
akar melimpah pada bagian tanaman terinfeksi Baron Zambryski 1995.
Gambar 3. Mekanisme transfer T-DNA Agrobacterium
ke dalam sel tanaman Gelvin 2000 A.3. Ekspresi T-DNA pada genom tanaman
T-DNA mengandung gen berperan biosintesis senyawa opin yaitu turunan
gula dan asam amino. Opin diekskresikan tanaman ke lingkungan, dan dimetabolisasi oleh
Agrobacterium. Opin dimanfaatkan Agrobacterium sebagai sumber karbon dan nitrogen. Tujuan
Agrobacterium menginfeksi sel tanaman adalah untuk mensintesis senyawa opin Nillson Olsson 1997. Selain gen
sintesis opin, T-DNA mengandung onkogen yaitu gen penyandi pembentukan hormon pertumbuhan auksin dan sitokinin. Integrasi T-DNA di dalam kromosom
tanaman mengakibatkan ketidak seimbangan hormon sel tanaman, sehingga terjadi over produksi hormon. Hal tersebut menyebabkan pertumbuhan sel tidak
terkontrol, dan ekspresi gen tersebut membentuk akar rambut.
T r a n s f e r T -D N A d a r i A.rhizogenes
k e t a n a m a n
Induksi gen vir
V i r A V i r G
Plasmid R i Eksisi
T D N A Vir E 2
Vir D2
A T P
Vir D4
Vir B
R e s e p t o r tanaman
O C H 3 OH
C
C H 3 O
O C H 3
Asetosiringon p H a s a m
Gula
Pelukaan
Sitoplasmik transport
Opine
Integrasi
Sitokinin Auksin
S e l Tanaman
N P C
H a iry root
A.rhizogenes
A.4. Faktor yang mempengaruhi kultur akar rambut Faktor yang berpengaruh terhadap pertumbuhan akar rambut antara lain,
medium tumbuh, nutrisi, lingkungan biotik dan abiotik. Medium tumbuh di dalam kultur jaringan ada tiga jenis yaitu padat, semi padat dan cair. Medium
tumbuh harus dicukupi unsur makro dan mikro nutrien, baik kualitatif maupun kuantitatif tergantung keadaan fisiologi jaringan atau eksplan yang dikultur.
Susunan nutrien, tekanan osmosis dan kekuatan ion timbul di dalam sel berpengaruh pada pertumbuhan akar rambut Sikuli Demeyer 1997. Ernawati
1990 memperoleh media terbaik perangsang pertumbuhan akar rambut P.
tinchlorium. Ait., pada media Marashige dan Skoog MS 1962 yang mengandung 2mM NH
4
NO
3
1650 mgl. Di samping itu dengan penurunan unsur fosfor media dapat meningkatkan kandungan flavonoid.
Vitamin sering digunakan dalam kultur jaringan, di antaranya tiamin vitamin B
1
, asam nikotinat niasin dan pyridoksin B6. Vitamin berfungsi sebagai koenzim dalam metabolisme karbohidrat dan protein. Kecuali susunan
medium buatan, pilihan penggunaan medium padat atau cair menentukan keberhasilan suatu kultur tumbuhan. Pilihan medium padat atau cair umumnya
dilakukan sesuai kebutuhan dan tujuan penelitian serta fasilitas yang tersedia Gunawan 1992.
Lingkungan tumbuh mencakup suhu, kelembaban udara, pH dan cahaya, berpengaruh pada pertumbuhan kultur akar rambut. Lingkungan tumbuh optimum
untuk pertumbuhan kultur akar bervariasi antar spesies. Toivonen et al. 1992
memperoleh pertumbuhan akar rambut Catharanthus roseus paling cepat apabila
dikulturkan pada suhu 32
o
C dibandingkan dengan suhu 19,5
o
C dan 24
o
C. Pada kedua suhu tersebut akar berwarna cokelat dan terbentuk kalus.
Selain gen penyandi sintesis auksin dan sitokinin di dalam sel akar rambut, gen tersebut adalah gen
ipt berasal dari transformasi bakteri A. rhizogenes dan rantai samping isopentil asam mevalonat. Biosintesis zeatin terutama terjadi di
ujung akar dalam bibit yang berkecambah. Translokasi zeatin terutama melalui xilem Wattimena 1992. Sitokinin sintetik terdiri dari zeatin, benzil adenin purin
BAP, 2- iP, dan Kinetin.