Rhizogenes Teknologi Enkapsulasi Untuk Pengemasan
Lampiran 4. Isolasi DNA dengan modifikasi metode CTAB Orozco-Castilo
et al. 1994
Lampiran 5. Stacking gel 4.0 gel, 0.125 M tris pH 6.8
Bahan Kimia Volume
H
2
O 3.05 ml
61 ml Tris HCL 1.5 M pH 6.8
1.25 ml 2.5 ml
SDS 10 50 µl
100 µl Akrilamidabis30
0.65 µl 1.3
Campuran divakum 15 menit APS 10
25 µl 50 µl
TEMED 5µl
10µl Total
5 ml 10 ml
Lampiran 6. Skematis teknis perbanyakan CMA dengan kultur pot di rumah kaca
Lampiran 7 . Metode sieving spora Pacioni 1992 dan Brundrett, 1994
Sebanyak 50 gram Larutan gula 50
inokulum CMA hasil saringan Disentrifuge
20.000 rpm 5menit
air mengalir 3 menit
Spora siap disterilisasi enkapsulasi
450µm + 45µ m
1000µ m 450µ m
45µ m
45
µ m
45
µ m
Lampiran 8. Teknik sterilisasi spora CMA modifikasi Buce et al. 2000
spora
MgSO
4
.7H
2
O + Tween 20 steril
air air steril steril
Divorteks 2mnt cucian pertama dan diulang2X kedua divortek 1mnt,
disentrifus cairan dibuang cairan dibuang 10.000 rpm 2mnt
Ependorf steril 2ml cairan dibuang masing- masing dicuci akuades cairan
dibuang +Chloramin T22X divorteks steril 2 X, divortek,
dan sentrifuge 12.000 rpm 1mnt antibiotic cairan dibuang dicuci aquades cairan dibuang
-gentamisin,treptomisin steril 2 x, diforteks pinisillin,tetrasiklin, maing- masing 1x disentrifus 10.000 rpm 2mnt
diforteks 1mnt rendam campuran spora steril siap diinokulasikan
antibiotik yang digunakan dg kadar 50 ppm, disimpan
pada suhu 4
C, 24 jam
Lampiran 9. Metode sterilisasi spora CMA
Bahan sterilisasi Jenis sterilan
permukaan spora
spora Konsentrasi
Waktu proses
menit MgSO
4
.7H
2
O steril
- 0,1
2 Tween 20
Steril Bayclin
- 50 ppm
20 10
5 Sterptomisin
200 ppm 240
Pnisilin 200 ppm
240 Gentamisin
200 ppm 240
I Buce et al. 2000
Tetrasiklin 2,5 ppm
120 Tween 20
- 20
4 Khloramin T
- 2
45 Gentamisisn
200 ppm 45
II. Chabot 1992
Streptomisin 200 ppm
45 Alkohol
- 96
3 kalsium
hipoklorit -
50 4
Gentamisisn 200 ppm
60 III.Declereck
et al. 1998
Streptomisin 200 ppm
60
Lampiran 10. Modifikasi metode sterilisasi spora
Modifikasi I Modifikasi II
Modifikasi III Sterilisasi
Bahan Konsen
tarasi Wkt
mnt Konsen
Tarasi Wkt
mnt Konsen
Tarasi Wkt
mnt Kons
en tarasi
Wkt mnt
MgSO
4
steril 0,1
2 idem
4 idem
idem idem
idem Tween 20
50 ppm 10
30 5
20 10
10 15
Sterptomisin 200 ppm
240 150
ppm 200
150 ppm
100 100p
pm 100-120
Penisilin 200 ppm
240 150
ppm 200
150 ppm
100 100
ppm 100-120
Gentamisin 200 ppm
240 150
ppm 200
150 ppm
100 100
ppm 100-120
Tetrasiklin 2,5 ppm
120 idem
110 idem
130 idem
100-120 I
NaOCl Bayclin
20 5
idem 3
15 3
10 5
Tween 20 20
4 idem
3 15
2 10
4 Chlora min T
2 45
idem 30
idem 20
idem 10
Gentamis in 200 ppm
45 150 pm
60 idem
90 100
120 Streptomisin
200 ppm 45
150 pm 60
idem 90
100 120
II
Alkohol 96
2 idem
1 70
2 idem
3 Calsium
Hipokhlorit 50
4 15
10 10
10 idem
5 Streptomisin
sulfat 200 ppm
100 150
100 100
100 Idem
120 III
Gentamisin sulfat
200 ppm 100
150 100
100 100
idem 120
Lampiran 11 . Pembuatan preparat histologi akar inang kultur pot Koske Gemma 1989
Bahan : - 50 etanol
- 0,5 KOH
- 0,1 N HCl
- 2,5 H
2
O
2
- Gliserin 50
- Tripan biru
Trypan blue 0,02 Alat
: -
Botol -
Pinset - Saringan kasa
- Pengangas air - Mokroskop binokuler
Cara Kerja : 1. Diambil ujung akar dari percabangan sekunder dan atau tersier, masukkan
ke dalam tabung reaksi 2. Dicuci dengan air mengalir ledeng sampai bersih, selanjutnya air
dibuang 3. Dibersihkan dengan 2,5 KOH sampai akar terendam
4. Panaskan 70 C, selama 60 menit dalam pengangas air
5. Apabila akar belum nampak putih bersih, KOH dibuang, diganti denga H
2
O
2
di masukkan dalam pengangas air suhu 70 C 30 menit sampai akar
nampak putih bersih, waktu dan suhu dapat disesuaikan dengan kondisi preparat.
6. Buang larutan, cuci dengan akuades seteril 3 kali, akuades di buang 7. Masukkan larutan HCl 0,1 N, panaskan dalam pengangas air suhu 70
C selama 30 menit, cairan dibuang
8. masukkan pewarna trypan blue 0,02 dalam campuran air 30 dan gliserol
70, panaskan dalam pengangas air suhu 70 C selama 60 menit.
9. Inkubasi pada suhu ruangan selama 24 jam 10. Cuci pewarna dengan akuades sampai bersih
11. Selanjutnya direndam di dalam larutan 50 gliserol. 12. Potong akar secara acak sepanjang 1 cm sebanyak 10 potong setiap obyek
glas 13. Akar siap diamati di bawah mikroskop, untuk melihat perubahan struktur
CMA di dalam akar, dan menghitung tingkat infeksi akar Untuk menghitung persentase akar yang terinfeksi dengan rumus : Koske
Gemma 1989 akar yang terinfeksi = ? bidang pandang positif X 100
Ttl ? bidang pandang Positif dan Negatif
Lampiran 12. Proses enkaps ulasi Gigaspora margarita dan Acaulospora
tuberculata dengan Na-alginat
Produksi CMA in vivo
dan atau in vitro
Na-alginat , 1,5; 1,75; 2. Sebanyak 2 ml, di dalam cawan
Petri diameter 3 cm, distirer
Dipipet dengan mikropipet vol 1 ml
Dikeluarkan sedikit demi sedikit, ditampung
dan dibekukan di dalam larutan CaCl2 5
Dicuci dengan akuades sebanyak 5 kali, sambil
digoyang-goyang
Disimpan dalam botol berisi akuades
air steril Diaplikasikan
Lampiran 13. Waktu inisiasi dan jumlah tunas yang dibentuk dari tunas
aksiler tomat yang dikulturkan dalam medium MS.
Kadar kinetinppm Jumlah
Eksplan Wkt inisiasi
hari ke....... Jumlah tunas
yang terbentuk tunas
terbentuk
5 5
6 14
7 -
8 5
0,1 30
9 6
Jumlah eksplan yang terbentuk: -
30 100
5 9
6 15
0,5 30
7 6
Jumlah eksplan yang terbentuk: -
30 100
5 8
6 17
1,0 30
7 5
Jumlah eksplan yang terbentuk -
30 100
Lampiran 14. Hasil perhitungan persediaan inokulum steril dihasilkan Penelitian III BAB VI
Jenis CMA Jumlah
inokulum butir
Jenis Medium
perkecambahan Jumlah sporta
berkecambah butir
Jumlah total spora
berkecambah MM
75 56
Wortel: 15x5 = 75
MSR 24
18 Jumlah
74 MM
50 38
Tomat: 15x5 = 75
MSR 8
6 G. margarita
Jumlah 44
118 butir
spora G.
margarteta berkecambah
MM 76
76 Wortel:
20x5 = 100 MSR
19 19
95 MM
67 67
Tomat: 20x5=100
MSR 10
10 A. tuberculata
Jumlah 77
175 butir
spora A.
tuberculata berkecambah
Lampiran 15 A : PENELITIAN I
Pengaruh jenis media dan jenis tanaman terhadap berat kering akar rambut Penelitian I
Perlakuan BBK Akar Rambut
A Tempat 20,72
B Jenis CMA 21,45
ABTempat + Jenis CMA 18,65
CV 0,1266
Keterangan : signifikan,, Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan
Lampiran 15 B : PENELITIAN II
Pengaruh tiga faktor terhadap peubah umur 3 bulan setelah tanam Penelitian 2 Perlakuan
Biomassa Shoot Root
Rasio SR Jumlah
spora Infeksi
akar A Tempat
4,871 2564492
52,20 0,74
T S
B Jenis CMA 2,83
2003363 489,13
2,55
T S
ABTempat + Jenis CMA 725579
1686392 11,50
1,41
T S
C Jenis inang 2,46
53124,9 19,57
0,00
T S
AC Tempat + Jenis inang 1,556
2569534 0,54 TS
0,20
T S
BCJenis CMA+ Jenis inang 3875229
2137985 10,52
0,00
T S
ABCTempat + CMA + inang
1,426 1391941
0,54 TS 13,29
CV 0,0201
0,1537 5,1806 5,3077
Keterangan : signifikan, Sangat signifikan, TS Tidak signifikan
Pengaruh tiga faktor terhadap peubah umur 4 bulan setelah tanam Penelitian 2 Perlakuan
Biomassa Shoot Root
Rasio SR Jumlah
spora Infeksi
akar A Tempat
7,815 4534057
5,41 5,95
B Jenis CMA 4,175
2909901 5,35 1,60
TS
ABTempat + Jenis CMA 1,719
6402170 1,25
TS
7,00 C Jenis inang
2978015 4,924E7
2,19
T S
1,40
T S
AC Tempat + Jenis inang 3,133
4763683 1,25
T S
1,24
T S
BC Jenis CMA+ Jenis inang 182882 1,11E7
1,86
TS
1,40
T S
ABCTempat + CMA + inang
2,817 6342345
7,32
TS
1,18
T S
CV 0,014243
0,027734 25,21167
27,81928
Keterangan : signifikan, Sangat signifikan, TS Tidak signifikan
Pengaruh tiga faktor terhadap peubah umur 5 bulan setelah tanam Penelitian 2 Perlakuan
Biomassa Shoot Root
Rasio SR Jumlah
spora Infeksi
akar A Tempat
7,815 4534057
5,41 5,95
B Jenis CMA 2978015 2909901
5,35 1,60
T S
ABTempat + Jenis CMA 1,719
4,924 1,25
T S
7,00 C Jenis inang
2,817 4763683
2,19 1,40
T S
AC Tempat + Jenis inang 3,133
1,11 0,1484TS 1,18
T S
BC Jenis CMA+ Jenis inang 182882
6402170 1,86TS
1,40
T S
ABCTempat + CMA + inang 4,175
6342345 7,32TS
1,24
T S
CV 0,011804
0,032727 2,360159
1,773843
Keterangan : signifikan, Sangat signifikan, TS Tidak signifikan
Lampiran 15 C : PENELITIAN III
Pengaruh tiga Faktor terhadap peubah umur 3 bulan setelah tanam Penelitian III
Perlakuan Perkecambahan
Hifa eksternal
Jumlah spora
Infeksi akar
A Media 285,65
128,44 154,24 23,24 B Jenis CMA
0,44
T S
21,78 80,25 18,25 ABMedia + Jenis CMA
1,10
T S
0,44
T S
25,91 23,84 C Jenis inang
20,79 4,00
T S
2,65
T S
,63
T S
AC Media+ Jenis inang 0,40
T S
0,44
T S
2,03
T S
2,33
T S
BC Jenis CMA+ Jenis inang
3,05
T S
4,00
T S
2,65
T S
0,13
T S
ABCMedia + CMA + inang
0,45
T S
4,00
T S
2,03
T S
507,12 CV
23,81308 23,13862
38,83056 11,69684
Keterangan : signifikan,, Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan
Lampiran 15 D : PENELITIAN IV
Pengaruh jenis media terhadap berat kering dan basah akar rambut Perlakuan
BB Akar ambut
BBK AkarRambut
A Media MM 0,03
T S
2,94
T S
B Media MSR 0,10
T S
0,86
T S
ABMedia MM+MSR 0,05
T S
0,77
T S
CV 3,138371
7,951382
Keterangan : signifikan,, Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan
Pengaruh jenis inokulasi terhadap berat kering dan basah akar rambut
Perlakuan BB
Akar Rambut BBK
Akar Rambut A Media
0,05
T S
3,96
T S
B Jenis CMA 0,12
T S
0,93
T S
ABMedia + Jenis CMA 0,07
T S
0,97
T S
CV 3,239381
6,651382
Keterangan : signifikan,, Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan
Pengaruh dua faktor terhadap peubah umur 3 bulan setelah tanam Penelitian IV
Perlakuan Perkecamba
han Hifa
eksternal Jumlah
spora Infeksi
akar A Media
264,27 50,00 163,88 841,40
B Jenis CMA 600,93
289,50 152,97 1322,96 ABMedia + Jenis CMA
68,26 12,50
99,88 267,60 CV
11,23746 16,13743 25,87046 7,758628
Lampiran 15 E : PENELITIAN V
Pengaruh enkapsulasi spora terhadap jumlah spora dan infeksi akar Perlakuan
Jumlah spora
Infeksi Akar
A Alginat 59,69 198,43
B Jenis CMA 8,53
T S
82,54 ABAlginat + Jenis CMA
1,42
T S
15,87 CV
9,495292 4,777800