Rhizogenes Teknologi Enkapsulasi Untuk Pengemasan

Lampiran 4. Isolasi DNA dengan modifikasi metode CTAB Orozco-Castilo et al. 1994 Lampiran 5. Stacking gel 4.0 gel, 0.125 M tris pH 6.8 Bahan Kimia Volume H 2 O 3.05 ml 61 ml Tris HCL 1.5 M pH 6.8 1.25 ml 2.5 ml SDS 10 50 µl 100 µl Akrilamidabis30 0.65 µl 1.3 Campuran divakum 15 menit APS 10 25 µl 50 µl TEMED 5µl 10µl Total 5 ml 10 ml Lampiran 6. Skematis teknis perbanyakan CMA dengan kultur pot di rumah kaca Lampiran 7 . Metode sieving spora Pacioni 1992 dan Brundrett, 1994 Sebanyak 50 gram Larutan gula 50 inokulum CMA hasil saringan Disentrifuge 20.000 rpm 5menit air mengalir 3 menit Spora siap disterilisasi enkapsulasi 450µm + 45µ m 1000µ m 450µ m 45µ m 45 µ m 45 µ m Lampiran 8. Teknik sterilisasi spora CMA modifikasi Buce et al. 2000 spora MgSO 4 .7H 2 O + Tween 20 steril air air steril steril Divorteks 2mnt cucian pertama dan diulang2X kedua divortek 1mnt, disentrifus cairan dibuang cairan dibuang 10.000 rpm 2mnt Ependorf steril 2ml cairan dibuang masing- masing dicuci akuades cairan dibuang +Chloramin T22X divorteks steril 2 X, divortek, dan sentrifuge 12.000 rpm 1mnt antibiotic cairan dibuang dicuci aquades cairan dibuang -gentamisin,treptomisin steril 2 x, diforteks pinisillin,tetrasiklin, maing- masing 1x disentrifus 10.000 rpm 2mnt diforteks 1mnt rendam campuran spora steril siap diinokulasikan antibiotik yang digunakan dg kadar 50 ppm, disimpan pada suhu 4 C, 24 jam Lampiran 9. Metode sterilisasi spora CMA Bahan sterilisasi Jenis sterilan permukaan spora spora Konsentrasi Waktu proses menit MgSO 4 .7H 2 O steril - 0,1 2 Tween 20 Steril Bayclin - 50 ppm 20 10 5 Sterptomisin 200 ppm 240 Pnisilin 200 ppm 240 Gentamisin 200 ppm 240 I Buce et al. 2000 Tetrasiklin 2,5 ppm 120 Tween 20 - 20 4 Khloramin T - 2 45 Gentamisisn 200 ppm 45 II. Chabot 1992 Streptomisin 200 ppm 45 Alkohol - 96 3 kalsium hipoklorit - 50 4 Gentamisisn 200 ppm 60 III.Declereck et al. 1998 Streptomisin 200 ppm 60 Lampiran 10. Modifikasi metode sterilisasi spora Modifikasi I Modifikasi II Modifikasi III Sterilisasi Bahan Konsen tarasi Wkt mnt Konsen Tarasi Wkt mnt Konsen Tarasi Wkt mnt Kons en tarasi Wkt mnt MgSO 4 steril 0,1 2 idem 4 idem idem idem idem Tween 20 50 ppm 10 30 5 20 10 10 15 Sterptomisin 200 ppm 240 150 ppm 200 150 ppm 100 100p pm 100-120 Penisilin 200 ppm 240 150 ppm 200 150 ppm 100 100 ppm 100-120 Gentamisin 200 ppm 240 150 ppm 200 150 ppm 100 100 ppm 100-120 Tetrasiklin 2,5 ppm 120 idem 110 idem 130 idem 100-120 I NaOCl Bayclin 20 5 idem 3 15 3 10 5 Tween 20 20 4 idem 3 15 2 10 4 Chlora min T 2 45 idem 30 idem 20 idem 10 Gentamis in 200 ppm 45 150 pm 60 idem 90 100 120 Streptomisin 200 ppm 45 150 pm 60 idem 90 100 120 II Alkohol 96 2 idem 1 70 2 idem 3 Calsium Hipokhlorit 50 4 15 10 10 10 idem 5 Streptomisin sulfat 200 ppm 100 150 100 100 100 Idem 120 III Gentamisin sulfat 200 ppm 100 150 100 100 100 idem 120 Lampiran 11 . Pembuatan preparat histologi akar inang kultur pot Koske Gemma 1989 Bahan : - 50 etanol - 0,5 KOH - 0,1 N HCl - 2,5 H 2 O 2 - Gliserin 50 - Tripan biru Trypan blue 0,02 Alat : - Botol - Pinset - Saringan kasa - Pengangas air - Mokroskop binokuler Cara Kerja : 1. Diambil ujung akar dari percabangan sekunder dan atau tersier, masukkan ke dalam tabung reaksi 2. Dicuci dengan air mengalir ledeng sampai bersih, selanjutnya air dibuang 3. Dibersihkan dengan 2,5 KOH sampai akar terendam 4. Panaskan 70 C, selama 60 menit dalam pengangas air 5. Apabila akar belum nampak putih bersih, KOH dibuang, diganti denga H 2 O 2 di masukkan dalam pengangas air suhu 70 C 30 menit sampai akar nampak putih bersih, waktu dan suhu dapat disesuaikan dengan kondisi preparat. 6. Buang larutan, cuci dengan akuades seteril 3 kali, akuades di buang 7. Masukkan larutan HCl 0,1 N, panaskan dalam pengangas air suhu 70 C selama 30 menit, cairan dibuang 8. masukkan pewarna trypan blue 0,02 dalam campuran air 30 dan gliserol 70, panaskan dalam pengangas air suhu 70 C selama 60 menit. 9. Inkubasi pada suhu ruangan selama 24 jam 10. Cuci pewarna dengan akuades sampai bersih 11. Selanjutnya direndam di dalam larutan 50 gliserol. 12. Potong akar secara acak sepanjang 1 cm sebanyak 10 potong setiap obyek glas 13. Akar siap diamati di bawah mikroskop, untuk melihat perubahan struktur CMA di dalam akar, dan menghitung tingkat infeksi akar Untuk menghitung persentase akar yang terinfeksi dengan rumus : Koske Gemma 1989 akar yang terinfeksi = ? bidang pandang positif X 100 Ttl ? bidang pandang Positif dan Negatif Lampiran 12. Proses enkaps ulasi Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata dengan Na-alginat Produksi CMA in vivo dan atau in vitro Na-alginat , 1,5; 1,75; 2. Sebanyak 2 ml, di dalam cawan Petri diameter 3 cm, distirer Dipipet dengan mikropipet vol 1 ml Dikeluarkan sedikit demi sedikit, ditampung dan dibekukan di dalam larutan CaCl2 5 Dicuci dengan akuades sebanyak 5 kali, sambil digoyang-goyang Disimpan dalam botol berisi akuades air steril Diaplikasikan Lampiran 13. Waktu inisiasi dan jumlah tunas yang dibentuk dari tunas aksiler tomat yang dikulturkan dalam medium MS. Kadar kinetinppm Jumlah Eksplan Wkt inisiasi hari ke....... Jumlah tunas yang terbentuk tunas terbentuk 5 5 6 14 7 - 8 5 0,1 30 9 6 Jumlah eksplan yang terbentuk: - 30 100 5 9 6 15 0,5 30 7 6 Jumlah eksplan yang terbentuk: - 30 100 5 8 6 17 1,0 30 7 5 Jumlah eksplan yang terbentuk - 30 100 Lampiran 14. Hasil perhitungan persediaan inokulum steril dihasilkan Penelitian III BAB VI Jenis CMA Jumlah inokulum butir Jenis Medium perkecambahan Jumlah sporta berkecambah butir Jumlah total spora berkecambah MM 75 56 Wortel: 15x5 = 75 MSR 24 18 Jumlah 74 MM 50 38 Tomat: 15x5 = 75 MSR 8 6 G. margarita Jumlah 44 118 butir spora G. margarteta berkecambah MM 76 76 Wortel: 20x5 = 100 MSR 19 19 95 MM 67 67 Tomat: 20x5=100 MSR 10 10 A. tuberculata Jumlah 77 175 butir spora A. tuberculata berkecambah Lampiran 15 A : PENELITIAN I Pengaruh jenis media dan jenis tanaman terhadap berat kering akar rambut Penelitian I Perlakuan BBK Akar Rambut A Tempat 20,72 B Jenis CMA 21,45 ABTempat + Jenis CMA 18,65 CV 0,1266 Keterangan : signifikan,, Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan Lampiran 15 B : PENELITIAN II Pengaruh tiga faktor terhadap peubah umur 3 bulan setelah tanam Penelitian 2 Perlakuan Biomassa Shoot Root Rasio SR Jumlah spora Infeksi akar A Tempat 4,871 2564492 52,20 0,74 T S B Jenis CMA 2,83 2003363 489,13 2,55 T S ABTempat + Jenis CMA 725579 1686392 11,50 1,41 T S C Jenis inang 2,46 53124,9 19,57 0,00 T S AC Tempat + Jenis inang 1,556 2569534 0,54 TS 0,20 T S BCJenis CMA+ Jenis inang 3875229 2137985 10,52 0,00 T S ABCTempat + CMA + inang 1,426 1391941 0,54 TS 13,29 CV 0,0201 0,1537 5,1806 5,3077 Keterangan : signifikan, Sangat signifikan, TS Tidak signifikan Pengaruh tiga faktor terhadap peubah umur 4 bulan setelah tanam Penelitian 2 Perlakuan Biomassa Shoot Root Rasio SR Jumlah spora Infeksi akar A Tempat 7,815 4534057 5,41 5,95 B Jenis CMA 4,175 2909901 5,35 1,60 TS ABTempat + Jenis CMA 1,719 6402170 1,25 TS 7,00 C Jenis inang 2978015 4,924E7 2,19 T S 1,40 T S AC Tempat + Jenis inang 3,133 4763683 1,25 T S 1,24 T S BC Jenis CMA+ Jenis inang 182882 1,11E7 1,86 TS 1,40 T S ABCTempat + CMA + inang 2,817 6342345 7,32 TS 1,18 T S CV 0,014243 0,027734 25,21167 27,81928 Keterangan : signifikan, Sangat signifikan, TS Tidak signifikan Pengaruh tiga faktor terhadap peubah umur 5 bulan setelah tanam Penelitian 2 Perlakuan Biomassa Shoot Root Rasio SR Jumlah spora Infeksi akar A Tempat 7,815 4534057 5,41 5,95 B Jenis CMA 2978015 2909901 5,35 1,60 T S ABTempat + Jenis CMA 1,719 4,924 1,25 T S 7,00 C Jenis inang 2,817 4763683 2,19 1,40 T S AC Tempat + Jenis inang 3,133 1,11 0,1484TS 1,18 T S BC Jenis CMA+ Jenis inang 182882 6402170 1,86TS 1,40 T S ABCTempat + CMA + inang 4,175 6342345 7,32TS 1,24 T S CV 0,011804 0,032727 2,360159 1,773843 Keterangan : signifikan, Sangat signifikan, TS Tidak signifikan Lampiran 15 C : PENELITIAN III Pengaruh tiga Faktor terhadap peubah umur 3 bulan setelah tanam Penelitian III Perlakuan Perkecambahan Hifa eksternal Jumlah spora Infeksi akar A Media 285,65 128,44 154,24 23,24 B Jenis CMA 0,44 T S 21,78 80,25 18,25 ABMedia + Jenis CMA 1,10 T S 0,44 T S 25,91 23,84 C Jenis inang 20,79 4,00 T S 2,65 T S ,63 T S AC Media+ Jenis inang 0,40 T S 0,44 T S 2,03 T S 2,33 T S BC Jenis CMA+ Jenis inang 3,05 T S 4,00 T S 2,65 T S 0,13 T S ABCMedia + CMA + inang 0,45 T S 4,00 T S 2,03 T S 507,12 CV 23,81308 23,13862 38,83056 11,69684 Keterangan : signifikan,, Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan Lampiran 15 D : PENELITIAN IV Pengaruh jenis media terhadap berat kering dan basah akar rambut Perlakuan BB Akar ambut BBK AkarRambut A Media MM 0,03 T S 2,94 T S B Media MSR 0,10 T S 0,86 T S ABMedia MM+MSR 0,05 T S 0,77 T S CV 3,138371 7,951382 Keterangan : signifikan,, Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan Pengaruh jenis inokulasi terhadap berat kering dan basah akar rambut Perlakuan BB Akar Rambut BBK Akar Rambut A Media 0,05 T S 3,96 T S B Jenis CMA 0,12 T S 0,93 T S ABMedia + Jenis CMA 0,07 T S 0,97 T S CV 3,239381 6,651382 Keterangan : signifikan,, Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan Pengaruh dua faktor terhadap peubah umur 3 bulan setelah tanam Penelitian IV Perlakuan Perkecamba han Hifa eksternal Jumlah spora Infeksi akar A Media 264,27 50,00 163,88 841,40 B Jenis CMA 600,93 289,50 152,97 1322,96 ABMedia + Jenis CMA 68,26 12,50 99,88 267,60 CV 11,23746 16,13743 25,87046 7,758628 Lampiran 15 E : PENELITIAN V Pengaruh enkapsulasi spora terhadap jumlah spora dan infeksi akar Perlakuan Jumlah spora Infeksi Akar A Alginat 59,69 198,43 B Jenis CMA 8,53 T S 82,54 ABAlginat + Jenis CMA 1,42 T S 15,87 CV 9,495292 4,777800

BAB I PENDAHULUAN

Latar Belakang Cendawan mikorhiza arbuskula CMA adalah mikroorganisme tanah berperana n penting memperbaiki produktivitas lahan, bersifat simbion obligat, karena tanpa tanaman inang asimbiotik pertumbuhan hifa tidak berkembang dan hanya mampu bertahan hidup 20-30 hari Fortin et al. 2002. CMA juga berperan penting dalam siklus hara, memperbaiki struktur tanah dan menyalurkan unsur karbon dari akar ke organisme tanah lainnya. Selain itu CMA juga mampu mengeluarkan enzim fosfatase dan asam organik, sehingga pada tanah yang kahat P, CMA mampu melepas P yang terikat membantu penyediaan unsur P tanah Smith et al. 2003. Di dalam simbiosis, CMA memperoleh energi dari fotosintat tanaman dan tanaman memperoleh manfaat dari CMA tergant ung kedua simbion tersebut tanaman dan CMA, serta karakteristik lingkungan Bever 2002, Heijden 2002. Jasa paling utama diberikan oleh CMA berupa pengambilan, asimilasi, dan translokasi nutrisi di luar zona rhizosfir kepada akar tanaman. Pengambilan hara dilaksanakan oleh ekstraradikal miselium Ezawa et al. 2002, Johansen et al. 1993. Penggunaan CMA umumnya meningkatkan kesuburan tanaman, daya tahan terhadap serangan patogen dan kekeringan Ezawa et al. 2002. CMA juga menguntungkan untuk pertanian Jeffries et al. 2003 maupun reklamasi lahan Jasper 1994, de-Souza Sulva 1996, dan sebagai sumber daya efisien yang dapat diperbaharui Jakobsen 2000. Menurut Hardjowigeno 1995 dalam Baon 1996 umumnya kondisi lahan di Indonesia hampir 30 luas daratan Nusantara bereaksi masam dengan pH berkisar 4,0 – 5,5. Jenis tanah masam paling luas di Indonesia adalah jenis tanah podzolik merah kuning PMK. Tanah ini umumnya bersifat marjinal, karena kebutuhan unsur-unsur makro tanaman terfiksasi oleh unsur lain. Tanah marjinal merupakan lahan bermasalah baik untuk pertumbuhan maupun perkembangan tanaman, sedang tanaman kehutanan dan perkebunan umumnya ditanam dalam kondisi tanah tersebut. Salah satu masalah pembatas pertumbuhan tanaman pada tanah marjinal adalah kemampuan serapan hara P. Simbiosis tanaman inang dan CMA dapat meningkatkan kemampuan akar tanaman untuk menyerap hara P. Hifa eksternal sebagai panjang tangan akar dapat membantu dalam serapan P, sehingga nutrisi P tanaman meningkat. Clark 1997 menyatakan bahwa ada peningkatan penyerapan mineral P dan Zn serta konsentrasi mineral oleh tanaman bermikorhiza, sekalipun terjadi defisiensi hara seperti Ca, Mg, dan K pada tanah masam. Namun demikian tanaman bermikorhiza juga mampu meningkatkan unsur N dan K Smith Read 1997 serta unsur mikro seperti Cu dan Zn Marschner Dell 1994. Hal tersebut menunjukkan bahwa manfaat CMA sangat luas, oleh karena itu perlu diupayakan teknik memperbanyak CMA yang lebih efisien dan efektif. Gigaspora margarita adalah salah satu CMA yang berhasil dikembangkan melalui kultur in vitro. Jenis CMA tersebut infektif dan efektif terhadap pertumbuhan tanaman perkebunan, di antaranya tanaman kelapa sawit Widiastuti 2004, kakao, jambu mente Trisilawati 2001. Di satu sisi A. tuberculata juga efisien terhadap pertumbuhan tanaman perkebunan Widiastuti 2004, tanaman manggis Lucia 2005. Schulz et al. 1999 menyatakan bahwa A. tuberculata adalah CMA yang efektif untuk meningkatkan daya hidup planlet kelapa sawit, dari 40 tidak diinokulasi, menjadi 91 diinokulasi dengan CMA. Acaulospora tuberculata merupakan salah satu CMA yang belum dikembangkan secara in vitro. Kedua jenis CMA infektif dan efektif terhadap pertumbuhan tanaman perkebunan, pertanian dan hortikultura. Perkembangan dan perbanyakan jenis CMA tersebut sangat penting dipelajari untuk meningkatkan efisiensi, efektivitas, dan kualitasnya, sehingga penelitian untuk perbanyakan kultur aksenik spora in vitro menjadi sangat penting dilakukan. Upaya pengembangan kedua CMA tersebut masih mengalami kendala, khususnya perbanyakan secara masal menggunakan teknik konvensional kultur pot, karena itu inovasi teknologi sangat diperlukan. Sampai sejauh ini di Indonesia belum diperoleh laporan pengembangan kultur aksenik G. margarita dan A. tuberculata baik secara monoaksenik maupun kultur akar rambut. Bahkan untuk A. tuberculata belum ditemukan jurnal luar negeri yang melaporkan perbanyakan atau perkembangan CMA tersebut secara in vitro. Laporan hasil