Perkembangan spora kultur aksenik

93 Lucia 2005, Diop et al 1994, de-Souza 2005. Hasil tersebut menunjukkan bahwa perbedaan inang dan medium tidak mempengaruhi waktu perkecambahan, tetapi dapat menghambat perkembangan lebih lanjut antara kedua CMA uji. Mungkin berkaitan dengan konsentrasi P dalam medium, atau kompatibilitas inang. Inang yang kompatibel dapat meningkatkan perkecambahan, infeksi akar dan sporulasi spora CMA Bagyaraj 1992, Bakhtiar 2002, Baron et al. 1995 . Eksudat akar memberi pengaruh sangat signifikan dalam perkembangan spora CMA steril, karena dapat memacu pecahnya tabung perkecambahan dan berkembangnya hifa eksternal, juga menyediakan karbon sebagai sumber energi, serta mempengaruhi status fisiologis CMA Juge et al. 2002, Diop et al. 1994. Perkecambahan spora CMA dan berkembangnya hifa merupakan titik awal yang sangat penting terjadinya asosiasi antara CMA dan inang Orcutt Nielsen 2000. Perlakuan dengan terapi suhu rendah 4 o C, salah satu cara mematahkan dormansi, sehingga dapat merangsang percepatan proses perkecambahan Fortin et al. 2002. Medium MM lebih sesuai untuk perkecambahan, sporulasi, dan infeksi akar tanaman inang dan CMA uji steril, karena kandungan fosfat lebih rendah 4,8 mgl dibandingkan dengan medium MSR yaitu 44 mgl. Hal tersebut mungkin terkait dengan perbedaan konsentrasi P kedua medium tersebut. Konsentrasi P tinggi dapat menghambat terbentuknya eksudat akar, di satu sisi eksudat akar sangat diperlukan didalam perkembangan CMA steril, dari mulai fungsi penanda sinyal sampai terjadi perkecambahan spora, hifa berkembang, dan menginfeksi akar sampai terbentuk asosiasi dari kedua simbion, yang ditandai dengan terbentuknya struktur organ CMA dalam kortek akar Labour et al. 2003. Hal tersebut terlihat adanya hubungan yang signifikan antara konsentrasi P dan pembentukan eksudat akar. Semakin tinggi konsentrasi P eksudat akar menurun dan sebaliknya Pinior et al. 1999, Ezawa et al. 2000. Tamasloukht et al. 2003 menyatakan bahwa simbiosis antara CMA dengan akar tanaman inang dimulai setelah spora berkecambah, ditandai dengan percabangan hifa eksternal aktif, berkembang dan kontak dengan akar membentuk appresorium, dan membentuk hifa internal, hifa interseluler, arbuskula dan vesikula pada A. tuberculata sedang G. margarita tidak membentuk 94 vesikula, selanjutnya dapat membentuk spora baru sporulasi. Jane et al. 1998 menyatakan bahwa spora berkecambah melakukan kontak dengan akar membentuk apresorium dan berkembang membentuk hifa internal, hifa intrasel, arbuskula, vesikula dan hifa koil. Perkembangan spora CMA dalam kortek akar mengalami perubahan struktur organ CMA yang terlihat dengan pewarnaan tripan blue. Hasil sporulasi rendah, dapat disebabkan oleh beberapa hal yaitu faktor lingkungan, media, inang dan umur kultur baru 3 bulan. CMA uji asli Indonesia, yang mempunyai suhu lingkungan rata-rata antara 30-31 o C, dan kultur diinkubasi di ruang dengan suhu 26 o C, kurang sesuai dengan kondisi habitat alamnya, sehingga dimungkinkan faktor suhu ruang me nghambat sporulasi. Media dapat mempengaruhi perkembangan CMA, atau sporulasi secara tidak langsung, terkait dengan konsentrasi unsur P. Semakin rendah P dalam medium, meningkatkan eksudat akar, yang berperan dalam perkecambahan dan perkembangan hifa, sehingga CMA berkembang lebih optimal menginfeksi akar dan bersporulasi Pinior et al. 1999, Ezawa et al. 2000, Labour et al. 2003. Peran inang dalam perkembangan kultur aksenik terkait dengan sifat obligat CMA, yaitu tanpa inang tidak dapat berkembang secara optimal, karena sumber karbon untuk pertumbuhan dan perkembangan CMA membutuhkan bantuan tanaman. Hanya inang yang kompatibel akan meningkatkan daya infektiv dan efektiv CMA Sancayaningsih 2005, Mansur et al. 2001 dan Lucia 2005. Perkembangan CMA membutuhkan waktu untuk berproses, hal tersebut nampak bahwa hasil pengamatan dari kultur pot, waktu 3, 4 dan 5 bulan meningkat baik persentase infeksi akar dan dan jumlah spora Penelitian II. Hal tersebut menunjukkan bahwa umur dapat meningkatkan perkembangan dan perbanyakan spora CMA Vaast Zasoski 1998. Diop et al. 1992 menyatakan bahwa sporulasi G. margarita meningkat setelah umur 4 bulan diinokulasi. Sporulasi lebih aktif dimulai 6-12 bulan setelah inokulasi. Namun menurut de- Souza 2005 pembentukan spora Glomus pertama diperkirakan antara 10-12 minggu 2-3 bulan setelah kolonisasi, sporulasi terjadi setelah 5–8 bulan, dan rata-rata produksi spora 56 butir setiap 30 ml, demikian pula pernyataan yang mendukung dari de-Souza 2005 dan Vaast Zasoski 1991. Dari uraian 95 tersebut menunjukkan bahwa meningkatnya umur kultur, cenderung meningkatkan sporulasi dan persentase infeksi akar. Diop Declerck 2003 menyatakan bahwa terbentuknya struktur CMA dalam akar, sebagai ciri khas bahwa simbiosis tersebut sudah stabil, dan selanjutnya meningkatkan peran dari masing- masing simbion. Berkembangnya hifa eksternal merupakan sarana awal proses simbiosis, karena hifa akan menginfeksi akar, selanjutnya berperan di dalam pengambilan karbon sebagai sumber energi pertumbuhan dan perkembangan CMA. Sebaliknya CMA membantu dalam pengambilan nutrisi dan air melalui hifa, proses fotosintesis meningkat, sehingga memacu pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Hasil diperoleh menunjukkan bahwa perkembangan hifa paling banyak pada eksplan wortel yang diinokulasi dengan A. tuberculata bila dibandingkan dengan G. margarita, sehingga disimpulkan bahwa eksplan wortel lebih kompatibel untuk perkembangan spora A. tuberculata. Wilson Tommerup 1999 menyatakan bahwa flavonoid atau isoflavonoid merupakan eksudat akar yang mempengaruhi perluasan hifa kearah akar. Penyebaran hifa dipengaruhi oleh faktor internal dan faktor eksternal. Faktor internal meliputi infektivitas dan efektivitas CMA, perkembangan hifa, agresifitas dan kepadatan propagul. Sedang faktor eksternal meliputi medium khususnya persediaan P, pH, suhu dan pencemaran. Infeksi hifa diawali dengan terbentuknya apresorium, menembus dinding sel tanaman, sebagai awal terjadinya simbiosis antara CMA dan akar tanaman. Sela njutnya terjadi perubahan struktur organ CMA membentuk organ penting di antaranya, arbuskula, vesikula dan hifa internal. Pembentukan organ CMA di dalam sel kortek akar menunjukkan adanya simbiosis dari kedua organisme tersebut stabil Diop Declerck 2002. Sehingga dapat dikatakan bahwa G. margarita dan A. tuberculata dapat dikembangkan secara in vitro. Dari hasil tersebut baik G. margarita maupun A. tuberculata paling baik dengan inang eksplan wortel yang dikultur pada medium MM. Hasil korelasi antar peubah menunjukkan bahwa setiap peubah berkorelasi positif dan sangat erat, hal tersebut dapat dimengerti karena perkecambahan, terbentuknya hifa eksternal maupun internal, dan sporulasi serta infeksi akar merupakan satu kesatuan perkembangan CMA. Hal tersebut mencerminkan 96 adanya simbiosis, dan simbiosis merupakan proses panjang dengan terbentuknya organ-organ CMA dalam akar, sehingga hasil yang diperoleh saling terkait. Diop Declerck 2002 menyatakan bahwa terbentuknya struktur organ CMA dalam kortek akar, merupakan ciri spesifik terjadinya simbiosis stabil.

4.4. Perubahan struktur organ CMA dalam akar

Perkembangan A. tuberculata Gambar 6.5. dan G. margarita Gambar 6.6., perkembangan spora muda ke spora masak digambarkan dengan perubahan warna G. margarita dan A. tuberculata Gambar 6.7., dan perkembangan struktur CMA didalam akar eksplan dari awal sampai dengan sporulasi Gambar 6.8.. Pada dasarnya siklus hidup CMA dibagi tiga tahap. Tahap pertama yaitu penetapan simbiosis melibatkan aktivitas propagul, inang tanaman, apresorium, penetrasi akar, dan arbuskula. Tahap kedua tahap pertumbuhan, melibatkan hifa eksternal, internal dan ekstraradikal secara keseluruhan dapat meningkatkan biomasa, pembentukan struktur hifa dan perluasan CMA di luar maupun antar tanaman. Tahap ketiga reproduktif, melibatkan struktur reproduktif, di antaranya spora, propagul, serta hifa eksternal. Spora dorman propagul, dan hifa merupakan organ reproduktif utama dari Acaulosporae dan organ reproduktif Gigasporaceae pada umumnya spora Heijden Sanders 2002, Heijden et al. 1998. Perkecambahan merupakan kunci perkembangan simbiosis CMA dan inang. Selanjutnya diikuti perkembangan hifa eksternal meluas dan menginfeksi akar. Hifa eksternal mempunyai arti penting sebagai kunci CMA menyangkut simbiosis, dan bertanggung jawab di dalam kolonisasi akar inang Smith Read 1997 Giovannetti et al. 2000, Giovannetti et al. 2003. Jasa paling utama CMA adalah pengambilan, asimilasi, dan translokasi nutrisi di luar zona rhizosfir kepada akar tanaman, dan tugas tersebut dilaksanakan oleh ekstraradikal miselium CMA Ezawa et al. 2002. Oleh karena itu umumnya CMA meningkatkan kesuburan tanaman, daya tahan terhadap serangan patogen, dan kekeringan Ezawa et al. 2002. CMA juga menguntungkan pertanian Jeffries et al. 2003, reklamasi lahan de-Souza Silva 1996. Penggunaan CMA merupakan sumber daya yang efisien dan dapat diperbaharui, di antaranya fosfat Jakobsen 2000. 97 Ada dua langkah penyebaran dan perkembangan ekstraradikal sistem monoaksenik in vitro yaitu, perkembangan hifa berfungsi sebagai alur meluas secara radikal, dan pengembangan struktur arbuskula berperan untuk mengambil nutrient Bago et al. 1998a. Miselium CMA adalah organ utama tidak bersekat dan mempunyai dua bentuk yaitu hifa jelajah berukuran lebih kecil dan hifa sekunder lebih besar Mosse 1981. Hifa tidak bersekat membawa sitoplasma dengan cepat, tidak hanya membawa sumber daya berkaitan dengan perkembangan dan penjelajahan hifa pada akar inang, tetapi juga mengangkut organel cendawan, yaitu mitokondria dan nukleus Bago et al. 1998b, Bago et al. 1999. Struktur miselia utama ditandai dengan struktur organ yang disebut arbuskula, yaitu struktur khusus berbentuk dikotomis, dan berkembang membentuk selaput penghub ung antara fungal dan selaput plasma tanaman. Arbuskula diduga sebagai alat penghubung lokalisasi nutrien dan pertukaran karbon antar kedua simbion tersebut, sehingga arbuskula dianggap struktur kunci simbiosis antara tanaman dan CMA. Struktur arbuskula umumnya berumur pendek 1–3 minggu, ditemukan di dalam akar muda dan pembentukan arbuskula dikendalikan oleh sifat tanaman inang, serta ketersediaan nutrisi Harrison 1999. Hifa internal berkembang membentuk gelembung yang disebut vesik ula berfungsi menyimpan lipid di dalam akar Declerck et al. 1998. Struktur tersebut jumlahnya meningkat sejalan berkembangnya koloni akar, dan hanya dibentuk oleh keluarga Acaulosporaceae, Glomeraceae , dan Pacisporaceae. Hasil penelitian tampak bahwa infeksi spora G. margarita dan A. tuberculata baik kondisi steril aksenik maupun tidak, memiliki pola perkembangan struktur organ yang sama, yaitu spora berkecambah, hifa berkembang dan menginfeksi akar. Di dalam korteks akar hifa internal berkembang membentuk arbuskula dan vesikula. Perkembangan struktur organ CMA sebagai ciri khas perkembangan stabil membentuk asosiasi atau simbiosis antara CMA dan inang. Hasil menunjukkan teknik kultur aksenik in vitro baik dikembangkan untuk produksi spora steril, mempelajari interaksi CMA dan tanaman inang, maupun sebagai sumber inokulum steril untuk perkembangan kultur aksenik CMA uji dengan akar mupun akar rambut.