Konsentrasi larutan uji ekstrak sebesar 100 ppm dan dosis paparan UV 60 mJcm
2
yang digunakan ditentukan berdasarkan hasil penentuan konsentrasi larutan uji dan dosis paparan UV Lampiran 2.
Perlakuan dan kontrol diinkubasi selama 2 jam. Setelah 2 jam, media DMEM dibuang dan digantikan dengan 200 µL PBS dan dilakukan paparan
radiasi UV 60 mJcm
2
. Sumber radiasi UV yang digunakan adalah lampu Phillips TL 20W12 RS florescent sun lamps dengan spektrum emisi 275 nm
hingga 380 nm. Bagian UV C dihilangkan dengan menggunakan filter UV C Kodacel filter TA401407. Kuat radiasi UV diukur dengan menggunakan UV
meter Waldmand model 585100.
Setelah paparan UV diberikan, larutan PBS dibuang dan kultur sel HaCat diberikan media DMEM. Kultur sel HaCaT diinkubasi selama 48 jam.
Setelah 48 jam, sebanyak 200 µL media kultur sel dipisahkan untuk penentuan ekspresi MMP-1 yang dikeluarkan sel HaCaT ke media dengan metode
western blott .
2.2.5 Western blotting
Sebanyak 200 µL media disentrifugasi pada 13000 rpm 4°C. Supernatan dipisahkan, selanjutnya 150 µL supernatan dicampur dengan 50 µL
SDS buffer sample , lalu divorteks. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan
3000 rpm pada temperatur ruang. Bila masih terdapat endapan, campuran divorteks kembali. Selanjutnya campuran dipanaskan pada suhu 90°C selama
5-10 menit. Bila masih terdapat endapan campuran divorteks kembali,
kemudian dipanaskan lagi pada suhu 90°C selama 5-10 menit. Sampel dapat disimpan pada lemari pendingin sampai digunakan kembali. Protein dipisahkan
dengan menggunakan 10 SDS-PAGE, kemudian ditransfer pada membran polyvinylidene fluoride
. Setelah proses transfer selesai, membran dicuci dua kali dengan menggunakan Tris Buffer Saline Tween 20 TBST, selanjutnya
membran diblok dengan skim milk
5 dalam TBST selama 1 jam pada temperatur ruang. Setelah proses blok, membran diinkubasi dengan antibodi
primer rabbit monoclonal anti-MMP-1 1:1000 pada temperatur 4 °C selama 12 jam. Selanjutnya membran diinkubasi dengan antibodi sekunder
anti- rabbitIgG-HRP conjugates
Santacruz company; 1:5000, selama 2 jam pada temperatur ruang dan kemudian dicuci dua kali dengan TBST. Protein
divisualisasi dengan pereaksi Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent
yang dipandu Protein Markers, kemudian dikembangkan pada film X-ray dengan menggunakan peralatan Kodak X-OMAT Processor
Chung et al. 2001; Shin et al.2005a. Ekspresi MMP-1 yang telah dikembangkan pada film X-ray dianalisis dengan menggunakan perangkat
lunak ImageJ 1.43u. Data ekspresi MMP-1 dianalisis dengan analisis sidik ragam satu arah One-way analysis of varianceANOVA menggunakan
perangkat lunak SPSS 17.0. Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan untuk menentukan keberartian perbedaan antara dua rataan.
2.2.6 Penentuan aktivitas antioksidan
Potensi antioksidan ekstrak tumbuhan kosmetik tradisional yang diuji diukur sebagai kapasitas total antioksidan. Kapasitas total antiokasidan diukur
berdasarkan kemampuan bahan tersebut dalam meredam Scavenging radikal
bebas DPPH. Prosedur yang digunakan mengadaptasi metode yang dikemukakan oleh Nepote et al. 2005, Que et al. 2006, Villano et al.
2006, Stef et al. 2009. Uji ini menggunakan rancangan acak lengkap yang terdiri atas 4
perlakuan. Perlakuan 1 merupakan larutan ekstrak rimpang Temu Giring dengan konsentrasi akhir 100 ppm dalam metanol. Perlakuan 2 merupakan
larutan ekstrak rimpang Temu Ireng dengan konsentrasi akhir 100 ppm dalam metanol. Perlakuan 3 merupakan larutan ekstrak rimpang Temu Putih dengan
konsentrasi akhir 100 ppm dalam metanol. Perlakuan 4 merupakan larutan ekstrak daun Ki Urat dengan konsentrasi akhir 100 ppm dalam metanol.
Masing-masing perlakuan dilakukan 3 kali pengulangan. Setiap perlakuan diberikan larutan radikal DPPH dengan konsentrasi akhir 0.1 mM dalam
metanol, kemudian diinkubasi selama 40 menit. Absorbansi DPPH diukur pada 517 nm. Prosedur yang sama dilakukan terhadap blanko yang berupa larutan
metanol. Parameter yang diukur adalah kapasitas total antioksidan TAC yang dihitung dengan cara :
TAC
DPPH
= A
blanko
– A
sampel
A
blanko
x 100 Data persentase kapasitas total antioksidan dinyatakan sebagai rataan
dari 3 kali pengulangan. Data dianalisis dengan analisis sidik ragam satu arah One-way analysis of variance ANOVA menggunakan perangkat lunak SPSS
17.0. Perbedaan rataan persentase kapasitas total antioksidan diuji lanjut dengan uji Duncan.
2.2.7 Penentuan Aktivitas Tabir Surya
Penapisan aktivitas tabir surya ekstrak yang diuji dilakukan dengan menggunakan peralatan SPF meter. Perlakuan terdiri atas: perlakuan 1 ekstrak
etanol rimpang Temu Giring; perlakuan 2 ekstrak etanol rimpang Temu Ireng; perlakuan 3 ekstrak etanol rimpang Temu Putih; perlakuan 4 ekstrak etanol
daun Ki Urat. Sampel dalam jumlah kecil dioleskan ke pitaplaster Transpore
®
. Sampel disebar secara tipis dan merata pada area 50 cm
2
yang setara dengan 2 µLcm
2
. Kemudian pitaplaster Transpore
®
ditempatkan pada bingkai logam terbuka. Selanjutnya dilakukan pengukuran menggunakan peralatan SPF meter
Optometrics SPF-290s Analyzer dengan range panjang gelombang 290-400 nm. Setiap perlakuan dilakukan pengulangan sebanyak 10 kali. Parameter
yang diukur adalah SPF. Pengukuran ini dilakukan pada selang panjang 290 nm hingga 400 nm. Data nilai SPF dinyatakan sebagai rataan dari 10 kali
pengulangan. Data dianalisis dengan analisis sidik ragam satu arah One-way analysis of variance ANOVA
menggunakan perangkat lunak SPSS 17.0. Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan untuk menentukan keberartian
perbedaan antara rataan.
2.3 Hasil
Tabel 1 berikut merangkum data rataan ekspresi MMP-1 pada aplikasi ekstrak terhadap sel HaCaT, kapasitas total antioksidan dan nilai SPF ekstrak
tumbuhan kosmetik tradisional Indonesia yang diuji.
