Kultur sel dibagi menjadi 4 kelompok, yaitu kontrol, kontrol negatif, perlakuan ekstrak Temu Ireng, dan perlakuan ekstrak Ki Urat yang masing-
masing terdiri atas 3 buah 35 mm cell culture dish. Kontrol merupakan kultur sel HDFs yang hanya mendapat media DMEM. Kontrol negatif merupakan
kultur sel HDFs hanya mendapat media DMEM dan paparan radiasi UV 100 mJcm
2
. Perlakuan ekstrak Temu Ireng merupakan kultur sel HDFs yang mendapat ekstrak Temu Ireng100 ppm dalam DMEM dan paparan radiasi UV
100 mJcm
2
. Perlakuan ekstrak Ki Urat merupakan kultur sel HDFs yang mendapat esktrak Ki Urat100 ppm dalam DMEM dan paparan radiasi UV 100
mJcm
2
. Pada penentuan potensi untuk menghambat penurunan pembentukan prokolagen I ini digunakan konsentrasi ekstrak Temu Ireng dan Ki Urat 100
ppm dan dosis UV 100 mJcm
2
yang ditentukan berdasarkan hasil pecobaan pendahuluan yang diuraikan pada Lampiran 7.
Semua kelompok sel diinkubasi selama 4 jam. Setelah 4 jam, media dibuang dan digantikan dengan 200 µL PBS. Dilakukan paparan radiasi UV
100 mJcm
2
terhadap kontrol negatif dan perlakuan yang mendapat paparan UV. Larutan PBS dibuang dan kultur sel HDFs diberikan media DMEM dan
diinkubasi selama selama 72 jam.
3.2.3.3 Penentuan ekspresi prokolagen tipe I dengan western blott
Lisat dari media dan kultur sel disentrifugasi pada 13000 rpm 4°C. Sebanyak 150 µL supernatan dipisahkan dan dicampur dengan 50 µL SDS
buffer sampel, lalu divorteks. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm pada temperatur ruang. Bila masih terdapat endapan campuran divorteks
kembali. Kemudian campuran dipanaskan pada suhu 90°C selama 5-10 menit. Bila masih terdapat endapan, campuran divorteks kembali, kemudian
dipanaskan lagi pada suhu 90°C selama 5-10 menit. Sampel disimpan pada lemari pendingin sampai digunakan kembali.
Protein pada sampel dipisahkan dengan menggunakan 10 SDS- PAGE, kemudian ditransfer pada membran polyvinylidene fluoride. Setelah
proses transfer selesai, membran dicuci dua kali dengan menggunakan Tris Buffer Saline Tween 20
TBST, selanjutnya membran diblok dengan 5 skim milk
dalam TBST selama 1 jam pada temperatur ruang. Setelah proses blocking selesai, membran diinkubasi dengan antibodi
primer mouse monoclonal anti-procollagen type I 1:1000 selama semalaman dalam temperatur 4°C selama 12 jam. Setelah inkubasi dengan antibodi
primer, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder anti-mouseIgG-HRP conjugates
1:5000, selama 2 jam pada temperatur ruang dan kemudian membran dicuci dua kali dengan TBST. Protein divisualisasi dengan
chemiluminescenceSuperSignal West Dura Substrate yang dipandu Protein
Markers kemudian dikembangkan pada film X-ray dengan menggunakan
peralatan Kodak X-OMAT Processor. Ekspresi prokolagen tipe I yang dikembangkan pada film X-ray
dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak ImageJ 1.43u, selanjutnya dilakukan pengamatan atas intensitas ekspresi prokolagen tipe I dari masing
masing perlakuan.
3.2.3.4 Analisis data
