3. METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli sampai November 2006, bertempat di Laboratorium Penanganan dan Pengolahan Hasil Perikanan serta
Laboratorium Biokomia Hasil Perikanan, Departemen Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Biokimia
Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Juga digunakan Laboratorium Rekayasa Reaksi Kimia dan Konservasi Gas Alam
RRK-KGA , Departemen Teknik Gas dan Petrokimia, Fakultas Teknik, Universitas Indonesia, untuk melakukan analisis derajat deasetilasi kitosan.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan silase adalah limbah udang yang diperoleh dari unit industri pembekuan udang di Muara Baru Jakarta,
molase, garam dan kubis untuk pembuatan starter bakteri asam laktat. Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk pembuatan kitosan adalah
HCl 1 N serta NaOH 3,5 dan 50 .. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan untuk analisa kimia adalah H
2
SO
4
, H
3
BO
3
, HCl, pelarut heksan dan lain-lain. Alat-alat yang digunakan dalam pembuatan silase dan kitosan serta
analisis kimia adalah timbangan, pengaduk, baskom, selang plastik, kain saring, plastik, gelas ukur, timbangan analitik, oven, tanur, nampan, cawan porselen, alat
destilasi, kjeltec system, soxhlet, gelas piala, desikator, kertas saring, labu lemak, erlenmeyer, kompor listrik, kertas pH, spektrofotometer infra merah dan lain-lain.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dalam dua tahap yaitu penelitian tahap I dan penelitian tahap II.
a Penelitian tahap I bertujuan untuk mengetahui pengaruh penambahan molase terhadap kualitas cairan silase dan ampas silase. Perlakuan yang diberikan
adalah penambahan molase sebesar 5 , 15 dan 25 . Pengujian mutu yang dilakukan pada silase adalah kadar protein, abu, lemak dan air.
Sedangkan parameter yang diujikan pada ampas silase adalah kadar protein
dan abu. Ampas silase yang berupa kulit udang yang tidak terurai selama proses pembuatan silase selanjutnya akan digunakan dalam penelitian
tahap II. b Pada penelitian tahap II dilakukan pembuatan kitosan dari ampas silase yang
diperoleh dari penelitian tahap I. Pembuatan kitosan terdiri dari proses demineralisasi, deproteinasi dan deasetilasi. Pengujian mutu kitosan yang
dilakukan yaitu kadar abu, nitrogen, air dan derajat deasetilasi.
3.3.1 Penelitian tahap I
a Penelitian tahap I dilakukan dengan mempersiapkan kubis terlebih dahulu sebagai bahan baku untuk pembuatan starter bakteri asam laktat. Kubis
dirajang sehingga menjadi potongan-potongan yang kecil, kemudian dimasukkan ke dalam wadah. Potongan kubis tersebut ditambahkan larutan
garam 2,5 hingga terendam dan diinkubasi selama 4 hari dalam wadah tertutup pada suhu kamar sampai tercium bau asam Gambar 4 .
b Pembuatan silase dimulai dengan pencucian limbah udang 12 kg dan dipotong kecil atau dihancurkan supaya dihasilkan campuran yang homogen.
Cacahan limbah udang lalu dibagi menjadi 6 bagian, untuk 3 perlakuan dan 2 kali ulangan. Kemudian cacahan limbah udang tersebut dicampur dengan
starter bakteri asam laktat sebanyak 75 ml0,6 kg limbah udang. Lalu campuran tersebut ditambahkan dengan molase 5 , 15 , 25 dan
diaduk supaya campuran menjadi homogen. Campuran ditempatkan ke dalam wadah yang tertutup dan difermentasi selama 10 hari pada suhu kamar.
Setelah proses fermentasi selesai, dilakukan penyaringan dengan menggunakan kain saring sehingga diperoleh cairan dan ampas silase. Cairan
silase ditempatkan dalam botol tertutup dan ampas silase yang diperoleh dicuci bersih dan dikeringkan. Ampas silase yang telah kering dapat
digunakan untuk bahan baku pembuatan kitosan Gambar 5 .
Kubis
Pencucian
Perajangan
Larutan garam 2,5 Pencampuran
Fermentasi dalam wadah tertutup, dalam suhu ruang selama 4 hari
Penyaringan
Filtrat Ampas
Starter Gambar 4 Skema proses pembuatan starter bakteri asam laktat
Suriawiria 1980
Limbah udang
Pencucian dan pemotongan
Starter Pencampuran Molase 75 ml 0,6 kg 5 , 15 , 25
Fermentasi dalam wadah tertutup, selama 10 hari dalam suhu ruang
Silase
Penyaringan
Filtrat Ampas silase
Cairan silase Pencucian
Pengeringan
Bahan baku pembuatan kitosan Gambar 5 Skema pembuatan silase limbah udang dan ampas silase kering
Modifikasi Kupepawati 1992 dan Suryani et al. 2005
3.3.2 Penelitian tahap II
Penelitian tahap II merupakan lanjutan dari penelitian tahap I yaitu pembuatan kitosan dari ampas silase udang yang dihasilkan dari penelitian
tahap I. Pembuatan kitosan terdiri dari beberapa tahap yaitu demineralisasi, deproteinasi dan deasetilasi Gambar 6 .
a Demineralisasi Demineralisasi bertujuan untuk menghilangkan mineral yang terdapat
pada ampas silase dengan menggunakan pelarut asam. Proses ini dilakukan dengan penambahan HCl 1 N dengan perbandingan bobot bahan dan volume
pengekstrak 1 : 7 bv , lalu dipanaskan pada suhu 90
o
C selama 1 jam disertai dengan pengadukan. Kemudian dilakukan penyaringan dan padatan yang
diperoleh dicuci dengan air beberapa kali sampai pH netral. b Deproteinasi
Proses ini dilakukan untuk menghilangkan protein dari ampas silase yang telah dipisahkan mineralnya. Deproteinasi dilakukan dengan menambahkan
NaOH 3,5 pada perbandingan 1 : 10 bv , lalu dipanaskan pada suhu 90
o
C selama 1 jam dan disertai pengadukan. Kemudian dilakukan penyaringan dan
padatan yang diperoleh dicuci dengan air beberapa kali sampai pH netral. Dari proses ini dihasilkan kitin.
c Deasetilasi Deasetilasi merupakan proses pengubahan kitin menjadi kitosan dengan
cara menghilangkan gugus asetil. Kitin yang diperoleh setelah deproteinasi dicampur dengan NaOH 50 dengan perbandingan 1 : 20 bv . Campuran
dipanaskan dengan suhu 100
o
C disertai pengadukan selama 1 jam. Selanjutnya dilakukan penyaringan dan padatan dicuci dengan air beberapa kali sampai pH
netral. Kitosan yang diperoleh dijemur pada sinar matahari selama 1 – 2 hari sampai kering dan dianalisis mutunya yang meliputi kadar abu, nitrogen, air dan
derajat deasetilasi.
Ampas silase limbah udang kering
HCl 1 N, 1:7 bv Demineralisasi suhu 90
o
C, 1 jam
Penyaringan dan pencucian
NaOH 3,5 , 1:10 bv Deproteinasi suhu 90
o
C, 1 jam
Penyaringan dan pencucian
Kitin
NaOH 50 , 1:20 bv Deasetilasi suhu 100
o
C, 1 jam
Penyaringan dan pencucian
Pengeringan
Kitosan
Gambar 6 Skema pembuatan kitosan dari ampas silase limbah udang Suptijah
et al . 1992
3.4 Analisis Kimia
Analisis dilakukan terhadap silase, ampas silase dan kitosan yang dihasilkan dari ampas silase. Analisis silase meliputi kadar protein, abu, lemak
dan air. Analisis ampas silase meliputi kadar protein dan abu. Analisis terhadap kitosan meliputi kadar abu, nitrogen, air dan derajat deasetilasi.
3.4.1 Kadar abu AOAC, 1995
Cawan porselen yang akan dipakai dikeringkan dalam oven selama 1 jam pada suhu 100
o
C, kemudian dimasukkan ke dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang beratnya. Sebanyak 3 – 5 g sampel dimasukkan ke dalam cawan
porselen dan ditimbang, lalu dibakar sampai tidak berasap. Kemudian diabukan dalam tanur dengan suhu 600
o
C. Setelah itu didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai diperoleh berat konstan.
Perhitungan :
Keterangan : A = Berat cawan dan sampel awal sebelum sampel diabukan
B = Berat cawan kosong C = Berat cawan dan sampel akhir setelah sampel diabukan
3.4.2 Kadar protein AOAC, 1995
Sampel ditimbang sebanyak 1 – 2 g lalu dimasukkan ke dalam labu kjeldahl. Setelah itu ditambahkan 1,9 g K
2
SO
4
, 40 mg HgO dan 2.0 ± 0,1 ml H
2
SO
4
lalu dididihkan sampai diperoleh cairan berwarna jernih. Cairan didinginkan, kemudian ditambahkan 5 ml akuades dan dipindahkan ke tabung
destilasi dan dibilas dengan akuades 5 – 10 ml. Selanjutnya ke dalam tabung destilasi ditambahkan sebanyak 10 – 12 ml larutan NaOH-NaS
2
O
3
. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer yang berisi 5 ml larutan
H
3
BO
3
dan 2 – 4 tetes indikator campuran 2 bagian merah metal 0,2 dan 1 bagian biru metal 0,2 dalam alkohol . Ujung tabung kondensor harus
terendam dalam larutan H
3
BO
3
. Setelah itu larutan dalam erlenmeyer diencerkan Kadar abu =
B A
B C
− −
x 100
sampai 50 ml dan dititrasi dengan HCl 0,02 N sampai terjadi perubahan warna menjadi merah muda. Analisa blanko dilakukan dengan prosedur yang sama
tanpa menggunakan sampel. Perhitungan :
Keterangan : A = ml HCl sampel
B = ml HCl blanko C = Berat sampel mg
3.4.3 Kadar air AOAC, 1995
Cawan kosong yang akan digunakan dikeringkan dalam oven pada suhu 100
o
C selama 15 menit, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang. Sampel sebanyak 2 g ditimbang dan diletakkan dalam
cawan, lalu dipanaskan dalam oven selama 3 – 4 jam pada suhu 105 – 110
o
C. Cawan kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang kembali sampai
mencapai berat konstan. Perhitungan :
Keterangan : A = Berat sampel + cawan sebelum dipanaskan
B = Berat sampel + cawan setelah dipanaskan C = Berat sampel
N = C
xNHClx B
A 007
, 14
− x 100
Kadar protein = N x 6,25
Kadar air = C
B A
− x 100
3.4.4 Kadar lemak AOAC, 1995
Metode yang digunakan dalam analisa lemak adalah metode ekstraksi soxhlet
. Labu lemak yang akan digunakan dikeringkan di dalan oven, lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang beratnya. Sampel sebanyak 5 g
dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet. Alat kondensor diletakkan di atasnya dan labu lemak diletakkan di bawahnya.
Pelarut heksan dimasukkan ke dalam labu lemak secukupnya. Selanjutnya dilakukan refluks selama minimal 5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke
dalam labu lemak terlihat jernih. Pelarut yang ada dalam labu lemak didestilasi, dan pelarut ditampung
kembali. Labu lemak yang berisi hasil ekstraksi kemudian dipanaskan di dalam oven pada suhu 105
o
C, lalu didinginkan dalam desikator. Selanjutnya labu beserta lemak didalamnya ditimbang.
Perhitungan :
Keterangan : A = Berat labu dan lemak awal sebelum ekstraksi
B = Berat labu lemak kosong C = Berat labu dan lemak akhir setelah ekstraksi
3.4.5 Derajat deasetilasi Robert 1997
Derajat deasetilasi kitosan dapat dideteksi dengan menggunakan spektrofotometer infra merah pada frekuensi berkisar antara 4000 cm
-1
sampai 400 cm
-1
. Sampel kitosan sebanyak 2 mg dan 200 mg KBr dicampurkan dan dihancurkan dengan mortar. Campuran yang telah homogen tersebut ditempatkan
dalam alat pengepresan dan dicetak menjadi pelet dengan tekanan 8 ton. Setelah persiapan selesai, selanjutnya derajat deasetilasi khitosan diukur dengan
menggunakan spektrofotometer infra merah. Kadar lemak =
B A
B C
− −
x 100
Pengukuran derajat deasetilasi diperoleh dari gambar kurva yang dihasilkan spektrofotometer. Puncak tertinggi dicatat dan diukur dari garis dasar
yang dipilih. Perhitungan :
po = Jarak antar garis dasar dengan garis singgung antar dua puncak tertinggi dengan panjang gelombang 1655 cm
-1
dan atau 3450 cm
-1
p = Jarak antar garis dasar dengan lembah terendah pada panjang gelombang 1655 cm
-1
dan atau 3450 cm
-1
Perbandingan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 1655 cm
-1
dengan panjang gelombang 3450 cm
-1
. Derajat deasetilasi dihitung dengan menggunakan rumus :
A
1655
= Absorbansi pada panjang gelombang 1655 cm
-1
A
3450
= Absorbansi pada panjang gelombang 3450 cm
-1
1.33 = Konstanta untuk derajat deasetilasi yang sempurna
3.5 Rancangan Percobaan
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan satu faktor yaitu perlakuan konsentrasi molase dengan dua kali ulangan. Model
rancangan tersebut adalah sebagai berikut : Yi =
μ + αi + εik
Keterangan : Yi
= nilai pengamatan μ
= nilai tengah umum rataan Nilai absorbansi = log
p po
Derajat deasetilasi = ⎥
⎦ ⎤
⎢ ⎣
⎡ ⎟⎟
⎠ ⎞
⎜⎜ ⎝
⎛ −
33 .
1 1
1
3450 1655
x A
A x 100
αi = pengaruh perlakuan ke-i
εik = galat percobaan pada perlakuan ke-i pada ulangan ke-k
4. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1
Penelitian Tahap I
Penelitian tahap I merupakan tahapan pembuatan silase limbah udang dengan penambahan molase sebagai sumber karbohidrat sebesar 5 , 15 dan
25 . Molase digunakan sebagai sumber energi bagi kehidupan bakteri asam laktat selama proses pembuatan silase berlangsung. Dari proses ini akan
diperoleh cairan silase dan ampas silase, yaitu kulit udang yang tidak terurai selama proses pembuatan silase. Ampas silase selanjutnya akan dimanfaatkan
sebagai bahan baku dalam pembuatan kitosan pada penelitian tahap II. Nilai rata- rata hasil analisis proksimat dari cairan dan ampas silase tertera pada Tabel 4.
Tabel 4 Nilai rata-rata hasil analisis cairan dan ampas silase Analisis Proksimat
Penambahan Molase 5
15 25
Cairan Silase ♦ Kadar protein
7,37 8,41
7,91 ♦ Kadar abu
1,43 2,65
4,97 ♦ Kadar lemak
1,63 0,99
0,18 ♦ Kadar air
88,99 86,51
75,21 ♦ Volume ml
1370 1400
1350 Ampas Silase
♦ Kadar protein 22,18
25,17 28,63
♦ Kadar abu 38,18
32,48 19,85
♦ Berat ampas g 227,38
210,95 214,67
Dari hasil penelitian tahap I ini, nilai rata-rata kadar protein cairan silase berkisar antara 7,37 – 8,41 , dan nilai rata-rata kadar abunya berkisar antara
1,43 – 4,97 . Sedangkan nilai rata-rata kadar protein dari ampas silase berkisar antara 22,18 – 28,63 , dan nilai rata-rata kadar abunya berkisar
antara 19,85 – 38,18 . Hasil penelitian tahap I ini menunjukkan kadar protein dan abu yang terkandung dalam ampas silase lebih tinggi dibandingkan dengan
kadar protein dan abu dari cairan silase. Hasil analisis ragam yang dilakukan menunjukkan bahwa perlakuan konsentrasi molase memberikan pengaruh yang
berbeda nyata terhadap kadar protein, abu dan lemak dari cairan silase.