akan menghasilkan kerusakan genetik. Hal ini kritis bagi timbulnya kanker. Oleh karena itu, proses regulasi siklus sel mampu berperan dalam pencegahan kanker
Ruddon, 2007.
4.11 Uji Apoptosis
Pengamatan apoptosis dilakukan dengan metode flowsitometri. Metode ini merupakan metode untuk menghitung sel hidup, sel nekrosis dan apoptosis secara
cepat. Pada uji ini digunakan suatu protein yaitu Annexin V yang dapat berikatan secara spesifik pada fosfatidilserin yang terdapat pada membran plasma sel
selama proses apoptosis. DNA pada sel yang rusak baik nekrosis maupun apoptosis akan diwarnai oleh propidium iodida PI yang menghasilkan
fluoresensi oranye hingga merah. Saat melewati sinar laser, sel akan tereksitasi dan menghamburkan cahayanya menghasilkan cahaya fluoresensi Brussaard, et
al., 2000; Demo, et al., 1999. Pengujian apoptosis pada sel T47D dilakukan dengan berbagai perlakuan.
Diantaranya adalah kontrol ditunjukkan pada Gambar 4.9, EEADP pada konsentrasi IC
50
yaitu 100 µgmL ditunjukkan pada Gambar 4.10, ½ IC
50
yaitu 50 µgmL ditunjukkan pada Gambar 4.11, EEADP-doksorubisin
1 8
IC
50
EEADP dan
1 8
IC
50
doksorubisin yaitu 12,5 µgmL dan 0,25 µgmL ditunjukkan pada Gambar 4.12 dan doksorubisin pada konsentrasi ½ IC
50
yaitu 1 µgmL ditunjukkan pada Gambar 4.13. Hasil uji apoptosis pada berbagai konsentrasi
dapat dilihat pada Tabel 4.8.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.8 Hasil pengujian apoptosis EEADP pada sel T47D
Jenis Perlakuan Kadar µgmL
R
1
R
2
R
3
R
4
Kontrol -
92,88 4,93
1,71 0,50
EEADP 1 x IC 100
50
16,72 81,52
1,23 0,58
EEADP ½ IC 50
50
51,13 46,81
1,70 0,48
Kb EEADP- Dok 12,5- 0,25
41,39 29,89
24,30 4,58
Doksorubisin 1
2,47 27,48
33,13 36,94
Keterangan: R1 = sel hidup, R2 = sel yang mengalami apoptosis awal, R3 = sel yang mengalami apoptosis akhir dan nekrosis awal, R4 = sel yang mengalami
nekrosis akhir late nekrosis.
Gambar 4.9 Gambaran persentase kondisi sel T47D kontrol
Gambar 4.10 Gambaran persentase kondisi sel T47D diberi 1 x IC
50
Sam ple ID: KS T47D
Patient ID: 1218.13 Acquisition Date: 18-Dec-13
G ate: No Gate
Total Events: 20000 Region
G ated
Total R1
92.88 92.88
R2 4.93
4.93 R3
1.71 1.71
R4 0.50
0.50 R2
R3 R4
R1
EEADP
Sam ple ID: PG 1 T47D
Patient ID: 1218.13 Acquisition Date: 18-Dec-13
Gate: No Gate Total Events: 20000
Region Gated
Total R1
16.72 16.72
R2 81.52
81.52 R3
1.23 1.23
R4 0.58
0.58 R2
R3 R4
R1
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.11 Gambaran persentase kondisi sel T47D yang diberi ½ IC
50
Gambar 4.12 Gambaran persentase kondisi sel T47D yang diberi EEADP-
EEADP
Doksorubisin
Sample ID: PG 12 T47D Patient ID: 1218.13
Acquisition Date: 18-Dec-13 Gate: No Gate
Total Events: 20000 Region
Gated Total
R1 51.13
51.13 R2
46.81 46.81
R3 1.70
1.70 R4
0.48 0.48
R2 R3
R4
R1
Sample ID: KB PG-D T47D Patient ID: 1218.13
Acquisition Date: 18-Dec-13 Gate: No Gate
Total Events: 20000 Region
Gated Total
R1 41.39
41.39 R2
29.89 29.89
R3 24.30
24.30 R4
4.58 4.58
R2 R3
R4
R1
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.13 Gambaran persentase kondisi sel T47D yang diberi Doksorubisin
Keterangan: Gambar atas menunjukkan gambaran sel secara keseluruhan
Gambar bawah adalah gambaran sel setelah dikelompokkan dan dipersentase.
Pada sel T47D yang diberi EEADP IC
50
terlihat persentase sel yang mengalami apoptosis awal 81,52, EEADP ½ IC
50
Persentase sel yang mengalami apoptosis akhir dan nekrosis awal pada pemberian EEADP IC
46,81 sedangkan yang diberi EEADP-doksorubisin terlihat persentase sel yang mengalami apoptosis
awal 29,89, doksorubisin 27,48 dan dibandingkan kontrol 4,93. Terlihat EEADP lebih banyak meningkatkan jumlah sel yang mengalami
apoptosis awal dibandingkan dengan doksorubisin maupun kombinasi EEADP.
50
sangat sedikit 1,23, EEADP ½ IC
50
Sam ple ID: D 12 T47D
Patient ID: 1218.13 Acquisition Date: 18-Dec-13
Gate: No Gate Total Events: 20000
Region Gated
Total R1
2.47 2.47
R2 27.48
27.48 R3
33.13 33.13
R4 36.94
36.94 R2
R3 R4
R1
1,70, yang diberi EEADP-doksorubisin terlihat persentase sel yang mengalami apoptosis
akhir dan nekrosis awal 24,30, doksorubisin 33,13 sedangkan pada kontrol sel 1,71. Sel yang mengalami late necrosis juga sangat sedikit. Pada sel T47D
Universitas Sumatera Utara
yang diberi EEADP IC
50
0,58, EEADP ½ IC
50
0,48, yang diberi EEADP- doksorubisin terlihat persentase sel yang mengalami late necrosis 4,58,
doksorubisin 36,94 sedangkan pada kontrol 0,50. Jumlah sel yang hidup pada kontrol 92,88, pada perlakuan dengan EEADP IC
50
16,72, EEADP ½ IC
50
EEADP dan kombinasinya menunjukkan aktivitas positif dalam apoptosis dengan metode flowsitometri menggunakan annexin V. Prinsip dari pelabelan
annexin V adalah pewarnaan pada phosphatidylserines PS yang terdapat pada membran luar sel. Sel apoptosis awal mengekspresikan PS pada luar membran
plasma. PS dapat terwarnai oleh label annexin V. Sel yang mengalami apoptosis akhir dan sel nekrosis akan kehilangan integritas membran selnya dan permeabel
terhadap pewarna annexin V Zimmermann dan Meyer, 2011. Mekanisme kerja dari EEADP kemungkinan berada pada fase apoptosis awal.
51,13, perlakuan dengan EEADP - doksorubisin 41,39 sedangkan dengan doksorubisin 2,47.
Potensi EEADP dalam memacu apoptosis sel kemungkinan disebabkan oleh senyawa flavonoid melalui beberapa mekanisme antara lain penghambatan
aktivitas DNA topoisomerase III, modulasi signalling pathways, penurunan ekspresi gen Bcl-2 dan Bcl-XL, peningkatan ekspresi gen Bax dan Bak serta
aktivasi endonuklease. Senyawa flavonoid menghambat proliferasi sel sel kanker pada manusia melalui inhibisi proses oksidatif yang dapat menyebabkan inisiasi
kanker. Mekanisme ini diperantarai penurunan enzim xanthin oksidase, Cyclooxygenase COX dan Lipooxygenase LOX yang diperlukan dalam
proses peroksidasi sehingga menunda siklus sel. Topoisomerase merupakan enzim yang berfungsi memotong DNA yang berlilitan ketat akibat pembukaan
Universitas Sumatera Utara
double strand DNA oleh enzim helikase, memutar balik dan kemudian menyambungkan lagi. Jika terjadi penghambatan terhadap aktivitas topoisomerase
akan menghasilkan kerusakan DNA yang permanen dan mengaktivasi p53 dan memicu apoptosis Chen, et al., 2006.
4.12 Pengamatan Ekspresi Protein Bcl-2 Dan Siklin D1
