Sterilisasi Alat dan Bahan Pengujian Sitotoksik Analisis Hasil Indeks Selektivitas

menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes, 1995. 3.5.5 Pemeriksaan tanin Ekstrak ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 3 menit dalam 100 mL air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukan adanya tanin Farnsworth, 1966. 3.5.6 Pemeriksaan steroidatriterpenoida Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan 20 mL n-heksana selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard. Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukan adanya steroida Harborne, 1987. 3.6 Pembuatan Ekstrak Etil asetat Daun Poguntano Sebanyak 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok dimasukkan kedalam sebuah bejana, kemudian dituangi dengan 75 bagian cairan penyari, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil sering diaduk. Setelah 5 hari sari diserkai, ampas diperas dan dicuci dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Sari dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan ditempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari. Dienaptuangkan dan disaring Depkes, 1979.

3.7 Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas sitotoksik ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai sehingga terhindar dari berbagai kontaminasi Universitas Sumatera Utara pengujian. Alat-alat gelas dan plastik yang akan digunakan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Lay, 1994. 3.8 Pembuatan Media 3.8.1 Pembuatan Media Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMEM Komposisi: DMEM sachet 10,4 gram Hepes 2 gram NaHCO 3 HCl 1N secukupnya 2 gram NaOH 1N secukupnya Aquabidest steril ad 1 liter Cara Pembuatan: Sebanyak 1 sachet DMEM, 2 gram Hepes dan 2 gram NaHCO 3 dimasukkan ke dalam erlenmeyer, tambahkan 800 mL aquabidest steril, homogenkan dengan menggunakan Stirer magnet. Ukur pH 7,2 – 7,4 dengan pH meter, untuk menyesuaikan pH dapat digunakan asam klorida 1 N bila larutan basa atau natrium hidroksida 1 N bila larutan asam sehingga pH sesuai dengan kondisi yang diharapkan tambahkan aquabidest steril sampai 1 L, lakukan sterilisasi dengan filter vaccum didalam LAF, dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat dan disimpan pada suhu 2 - 8 o

3.8.2 Pembuatan Media Komplit DMEM MK DMEM

C Sambrook, et al., 1989. Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10 Penisilin-Streptomisin 2 Fungizone Amphotericin B 0,5 DMEM ad 100 ml Universitas Sumatera Utara Cara Pembuatan: Semua bahan di atas dicampur dan dilakukan di dalam LAF, tiap botol MK diberi identitas nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat, disimpan pada suhu 2-8 o

3.8.3 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute RPMI

C Sambrook, et al., 1989. Komposisi: RPMI sachet 10,4 gram Hepes 2 gram NaHCO 3 HCl 1N secukupnya 2 gram NaOH 1N secukupnya Aquabidest steril ad 1 liter Cara Pembuatan: Sebanyak 1 sachet RPMI, 2 gram Hepes dan 2 gram NaHCO 3 dimasukkan ke dalam erlenmeyer, tambahkan 800 mL aquabidest steril, homogenkan dengan menggunakan Stirer magnet. Ukur pH 7,2 – 7,4 dengan pH meter, untuk menyesuaikan pH dapat digunakan asam klorida 1 N bila larutan basa atau natrium hidroksida 1 N bila larutan asam sehingga pH sesuai dengan kondisi yang diharapkan tambahkan aquabidest steril sampai 1 L, lakukan sterilisasi dengan filter vaccum didalam LAF, dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat dan disimpan pada suhu 2 - 8 o

3.8.4 Pembuatan media kultur lengkap MK-RPMI

C Sambrook, et al., 1989. Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10 Penisilin-Streptomisin 2 Fungizone Amphotericin B 0,5 RPMI ad 100 mL Universitas Sumatera Utara Cara Pembuatan: Campur semua bahan di atas dan dilakukan di dalam LAF, beri identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat, simpan pada suhu 2-8 o

3.8.5 Pembuatan Media M199

C Sambrook, et al,.1989. Komposisi: M199 sachet 9,5 gram Aquabidest 1 liter NaHCO 3 Hepes 2 gram 2,2 gram HCl 1 N secukupnya NaOH 1 N secukupnya Cara Pembuatan: Sebanyak 1 sachet M199, 2,2 gram NaHCO 3 , 2 gram Hepes dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer. Ditambahkan 800 mL aquabidest steril dan dihomogenkan menggunakan Stirer magnet. Ukur pH 7,2 – 7,4 dengan pH meter, untuk menyesuaikan pH dapat digunakan asam klorida 1 N bila larutan basa atau natrium hidroksida 1 N bila larutan asam sehingga pH sesuai dengan kondisi yang diharapkan. Ditambahkan aquabidest hingga volume 1 L dan dilakukan sterilisasi dengan filter vacum di dalam LAF. Dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril. Lakukan proses penyaringan dengan menggunakan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire date, nama pembuat. Media disimpan pada suhu 2 - 8 o

3.8.6 Pembuatan Media MK-M199

C Handayani, dkk., 2001. Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10 Penisilin-streptomisin 3 Fungison 1. M199 ad 100 mL Universitas Sumatera Utara Cara Pembuatan: Campur semua bahan di atas dan dilakukan di dalam LAF, beri identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat, simpan pada suhu 2-8 o C Handayani, dkk., 2001. 3.9 Penumbuhan Sel MCF-7, Sel T47D dan Sel Vero 3.9.1 Penumbuhan sel Dipersiapkan alat dan bahan dikondisikan pada suhu ruang. Pekerjaan dilakukan di LAF. Sebanyak 10 mL media penumbuh yang sesuai dengan masing- masing sel uji dimasukkan pada tabung konikel 15 mL. Diambil ampul dari freezer -80°C atau tangki nitrogen cair, dicairkan pada suhu kamar. Suspensi sel diambil dalam ampul, lalu dimasukkan tetes demi tetes ke dalam media penumbuh yang telah disiapkan. Disentrifus pada 600 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan 4 mL MK-media penumbuh resuspensi hingga homogen. Ditransfer masing-masing 2 mL ke dalam flask baru. Sebanyak 5 mL MK–media penumbuh ditambahkan ke dalam masing-masing flask. Lalu dihomogenkan. Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted. Dipastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask tidak menggerombol pada bagian tertentu. Diberi identitas pada flask, kemudian disimpan dalam inkubator CO 2

3.9.2 Subkultur

Doyle, et al. , 2000 . Alat dipersiapkan dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan, pengerjaan dilakukan pada LAF. Proses panen sel dilakukan dengan cara mengambil 500 µL panenan sel dan dimasukkan ke dalam flask kultur. Sebanyak 6 mL MK Universitas Sumatera Utara ditambahkan dan dihomogenkan. Inkubasi sel pada inkubator CO 2

3.9.3 Panen sel

dan diamati kondisi sel pada keesokan harinya Doyle, et al. , 2000 . Alat dipersiapkan dan bahan dikondisikan pada suhu ruangan, diamati kondisi sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluen, semua pekerjaan dilakukan pada LAF. Dibuang MK dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, lalu dicuci sel 2 kali dengan 5 mL PBS Phosphate Buffer Salin, ditambahkan 400 µL Tripsin-EDTA 0,25 secara merata, kemudian dilakukan inkubasi di dalam inkubator CO 2

3.9.4 Penghitungan sel

selama ± 5 menit dan ditambahkan 4 mL MK untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan mikropipet agar sel terlepas satu-satu tidak menggerombol. Lalu diamati keadaan sel pada mikroskop inverted. Resuspensi sel kembali jika masih ada sel yang menggerombol. Sel ditransfer ke dalam tabung konikel Doyle, et al. , 2000 . Alat dipersiapkan dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan, diambil 10 µL panenan sel dan dipipet ke dalam hemositometer. Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop dengan menggunakan counter. Gambar 3.1 Hemositometer. Universitas Sumatera Utara Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung A, B, C dan D, setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak. Dihitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang gelap mati dan sel yang berada dibatas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel dibatas kanan dan bawah ikut dihitung. Dihitung jumlah sel per mL dengan rumus Nugroho, et al., 2012: ∑selmL = ∑ sel A + ∑ sel B + ∑ sel C + ∑sel D 4 x 10 4 Dihitung jumlah total sel yang diperlukan. Misal: untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate maka jumlah total sel yang diperlukan adalah 1 x 10 4 sumuran x 100 sumuran dibuat lebih = 1 x 10 6 . Dihitung volume panenan sel yang diperlukan dalam mL dengan rumus: Volume panenan sel = Jumlah total sel yang diperlukan Jumlah sel terhitung ml Diambil volume panenan sel, ditransfer ke tabung konikel baru dan ditambahkan MK sampai total volume yang diperlukan. 3.10 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak sampel uji ditimbang sebanyak 50 mg dalam polytube, kemudian dilarutkan dalam dimetilsulfoksida DMSO sebanyak 1000 µL, di vortex agar sampel terlarut sempurna kemudian dicukupkan dengan media komplit - media penumbuh, kemudian dibuat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 250 µgmL, 125 µgmL, 62,5 µgmL, 31,25 µgmL dan 15,625 µgmL, semua pengenceran dilakukan dengan menggunakan media komplit. Universitas Sumatera Utara

3.11 Pengujian Sitotoksik

Tiap sel uji ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1 x 10 4 selsumuran dan diinkubasi dalam inkubator CO 2 5 bersuhu 37 o C selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium dibuang dan diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan ekstrak sampel uji berbagai konsentrasi dengan co-solvent DMSO Sigma dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO 2 5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS Sigma. Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μL media komplit - media penumbuh dan 10 μL MTT Sigma konsentrasi 5 mgmL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator CO 2 5 bersuhu 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, lalu plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama satu malam pada suhu kamar. Serapan dibaca dengan ELISA reader Bencmark Bio Rad pada panjang gelombang 595 nm Meiyanto, dkk., 2008.

3.12 Analisis Hasil

Data absorbansi yang diperoleh dari uji sitotoksik, sel dikonversi ke dalam persen sel hidup. Persen sel hidup dihitung menggunakan rumus: Hidup = absorbansi sel perlakuan– absorbansi kontrol media absorbansi kontrol media Sel − absorbansi kontrol media x100 Aktivitas sitotoksik dinyatakan dengan IC 50 konsentrasi yang menyebabkan kematian 50 populasi sel yang dianalisis dengan analisis probit menggunakan SPSS 17 Meiyanto, dkk., 2008. Universitas Sumatera Utara

3.13 Indeks Selektivitas

Sel ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1 x 10 4 selsumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan ekstrak pada berbagai konsentrasi dengan cosolvent DMSO Sigma dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO 2 5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS Sigma. Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μL media kultur dan 10 μL MTT Sigma 5 mgmL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator CO 2 Indek selektivitas dihitung menggunakan persamaan di bawah ini: Indek Selektivitas = IC50 Sel Vero IC50 Sel Kanker 5, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama satu malam. Serapan dibaca dengan ELISA reader Bencmark Bio Rad pada panjang gelombang 595 nm Nugroho, et al., 2012. 3.14 Uji Kombinasi Metode yang umum digunakan untuk mengevaluasi kombinasi obat adalah Isobologram dan Indeks Kombinasi IK: IK= D 1 Dx 1 + D 2 Dx Dx: konsentrasi satu senyawa tunggal yang dibutuhkan untuk memberikan efek sebesar efek kombinasi, yaitu IC 2 50 D1 dan D2: besarnya konsentrasi kedua senyawa untuk memberikan efek yang sama. terhadap pertumbuhan sel kanker payudara. Universitas Sumatera Utara Indeks kombinasi yang diperoleh diinterpretasikan pada Tabel 3.1 Reynolds dan Maurer, 2005. Tabel 3.1 Interpretasi nilai IK Indeks Kombinasi Kultur sel yang digunakan dalam kondisi 70 - 80 konfluen untuk dipanen. Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji kombinasi adalah 1 x 10 4 selsumuran 1 x 10 4 sel100 µL MK. Lalu dibuat pengenceran suspensi sel sehingga konsentrasi sel akhir 1 x 10 4 sel100 µL MK. Ditransfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 µL. Setiap kali mengisi 12 sumuran, resuspensi sel agar tetap homogen. Sebanyak 3 sumuran kosong disisakan untuk kontrol media. Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Sel diinkubasikan ke dalam inkubator selama 24 jam. Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel dan agen kemoterapi Doksorubisin untuk perlakuan. Seri konsentrasi ekstrak terdiri dari 4 konsentrasi: ½ IC 50 , 3 8 IC 50 , ¼ IC 50 dan 1 8 IC 50 . Seri konsentrasi doksorubisin terdiri dari 4 konsentrasi: ½ IC 50 , 3 8 IC 50 , ¼ IC 50 dan 1 8 IC 50 IK Interpretasi . Diambil plate yang telah berisi sel dari inkubator. Media sel dibuang dengan cara membalikkan plate 180 derajat di atas tempat buangan, kemudian plate ditekan secara perlahan di atas tisu untuk meniriskan sisa cairan. Sel dicuci dalam sumuran dengan masing-masing 100 µL PBS. PBS dibuang, ditiriskan sisa cairan dengan tisu. IK Interpretasi 0,1 sinergis sangat kuat 0,1 – 0,3 sinergis kuat 0,3 – 0,7 sinergis 0,7 – 0,9 sinergis ringan-sedang 0,9 – 1,1 mendekati additif 1,1 – 1,45 antagonis ringan-sedang 1,45 – 3,3 antagonis 1,45 3,3 antagonis kuat-sangat kuat Universitas Sumatera Utara Pada kelompok perlakuan kombinasi, dimasukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran masing-masing 50 µL dengan replikasi 3 kali triplo, kemudian ditambahkan seri konsentrasi doksorubisin untuk kombinasi masing- masing 50 µL. Pada kelompok perlakuan tunggal, dimasukkan seri konsentrasi sampel atau doksorubisin ke dalam sumuran masing-masing 50 µL dengan replikasi 3 kali triplo, kemudian ditambahkan MK masing-masing 50 µL ke dalam sumuran. Untuk kontrol sel, ditambahkan MK ke dalam sumuran yang berisi sel masing-masing 100 µL dengan replikasi 3 kali triplo. Untuk kontrol media, ditambahkan MK ke dalam sumuran yang kosong tanpa sel masing-masing 100 µL dengan replikasi 3 kali triplo. Diinkubasi di dalam inkubator CO 2 Dibuat stok MTT 5 mgmL dengan cara penimbangan 50 mg serbuk MTT, dilarutkan dalam 10 µL PBS dengan bantuan vortex. Dibuat reagen MTT untuk perlakuan 0,5 mgmL dengan cara diambil 1 mL stok MTT 5 mgmL dan diencerkan dengan MK sampai 10 mL. Reagen ini dibuat untuk 1 buah 96 well plate. Media sel dibuang, dicuci masing-masing dengan 1 0 0 μL PBS 1 kali. Ditambahkan 100 µL reagen MTT 0,5 mgmL 100 µL ke setiap sumuran, termasuk kontrol media tanpa sel. Diinkubasikan sel selama 2 - 4 jam di dalam inkubator sampai terbentuk kristal formazan yang ungu. Setelah 2 - 4 jam, kondisi sel diperiksa dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk, ditambahkan stopper SDS 10 dalam HCl 0,1 N. Plate dibungkus dengan kertas atau alumunium foil dan diinkubasikan di tempat gelap dan suhu kamar selama . Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap sel. Jika dalam waktu 24 jam belum terlihat efek sitotoksik, diinkubasikan kembali selama 24 jam waktu inkubasi total 24 - 48 jam. Universitas Sumatera Utara semalam. Keesokan harinya, plate di shaker selama 10 menit untuk melarutkan formazan. ELISA reader dihidupkan dan dimasukkan ke dalam ELISA reader. Dibaca absorbansi pada masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan λ= 595 nm dengan cara tekan tombol START. Setelah semua sumuran dibaca, tekan tombol STOP dan ELISA reader dimatikan. Setiap kali pembacaan di ELISA reader, dicatat di buku catatan pemakaian ELISA reader. Presentase sel hidup dihitung. Dihitung harga IK Indeks Kombinasi Nugroho, et al., 2012.

3.15 Pengujian Apoptosis Dan Siklus Sel Dengan Metode Flowsitometri