semalam. Keesokan harinya, plate di shaker selama 10 menit untuk melarutkan formazan. ELISA reader dihidupkan dan dimasukkan ke dalam ELISA reader.
Dibaca absorbansi pada masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan λ= 595 nm dengan cara tekan tombol START. Setelah semua sumuran
dibaca, tekan tombol STOP dan ELISA reader dimatikan. Setiap kali pembacaan di ELISA reader, dicatat di buku catatan pemakaian ELISA reader. Presentase sel
hidup dihitung. Dihitung harga IK Indeks Kombinasi Nugroho, et al., 2012.
3.15 Pengujian Apoptosis Dan Siklus Sel Dengan Metode Flowsitometri
Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji apoptosis adalah sebanyak 5 x 10
5
– 1 x 10
6
selsumuran yang kemudian ditanam pada microplate 6 sumuran, lalu diinkubasi selama 24 jam. Dibuang medium dan ditambahkan medium baru.
Keesokan harinya sel ditambahkan sampel uji lalu diinkubasi kembali selama 24 jam. Kemudian diambil media pada masing-masing sumuran pada tiap konsentrasi
lalu dimasukkan dalam tabung konikel 15 mL lalu media dicuci dengan PBS 1 kali dan dibuang. Ditambahkan tripsin 150 µL pada tiap sumuran lalu diinkubasi
selama 5 menit pada suhu 37
o
C. Setelah itu ditambahkan 1 mL media kultur lalu media ditampung pada tabung konikel 15 mL. Lalu dicuci dengan PBS 1 kali,
hasil cucian dipindahkan ke tabung konikel. Disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 2 menit dan supernatannya dibuang. Lalu ditambahkan
sebanyak 1 mL PBS diresuspensi kemudian media dipindahkan ke dalam tabung konikel 1,5 mL dan disentrifugasi lagi dengan kecepatan 3000 rpm selama 3
menit, setelah itu supernatannya dibuang. Kemudian ditambahkan propidium iodida dan diukur dengan alat flowsitometer Hostanska, et al., 2004.
Universitas Sumatera Utara
3.16 Uji Penekanan Ekspresi Protein Bcl-2 Dan Siklin D1 Dengan Metode Imunositokimia
Sebelum sel T47D ditanam terlebih dahulu pada masing-masing sumuran 24-well plate dimasukkan coverslip. Kemudian sel ditanam dengan kepadatan 5 x
10
5
selsumuran, lalu diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator CO
2
5 lalu dibuang medium. Sel yang telah diinkubasi kemudian ditambahkan larutan uji dan
doksorubisin sebagai kontrol positif dengan konsentrasi masing-masing 1 kali IC
50
dan ½ IC
50
. Pada kelompok kontrol, ditambahkan 1000 µl media kultur. Sel kembali diinkubasi selama 24 jam. Keesokan harinya larutan uji dan media kultur
dibuang. Kemudian dicuci dengan PBS 2 kali. Kemudian sel di fiksasi dengan metanol dingin selama 30 menit. Setelah itu coverslip di masing-masing sumuran
diangkat dengan pinset secara hati-hati dan diletakkan di atas kaca objek lalu dicuci dengan PBS 2 kali, lalu cuci dengan aquadest lalu keringkan, tambahkan
blocking serum lalu simpan pada sumur kamar diamkan 15 menit, lalu tambahkan antibodi primer Bcl-2siklin D1 diamkan 60 menit cuci PBS 2 kali, tambahkan
antibodi sekunder Bcl-2siklin D1 lalu keringkan, tambahkan larutan label dan cuci PBS 2 kali keringkan tambahkan campuran 1 : 100 DAB substrat lalu cuci
dengan aquadest lalu genangi dengan hematoxicillin dan divisualisasikan dengan reaksi warna.
Ekspresi Bcl-2siklin D1 diamati menggunakan mikroskop cahaya. Sel yang diamkan 10 menit. Ditambah etanol absolut lalu tambahkan xylol dan tambahkan
entelan. Mengekspresikan Bcl-2siklin D1 akan memberikan warna coklatgelap sedangkan yang tidak akan memberikan warna ungu biru. Jumlah sel dihitung
pada luasan tertentu, baik yang berwarna coklatgelap maupun yang berwarna ungubiru Sekti, dkk., 2010.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Bogor - Pusat Penelitian Biologi adalah jenis Picria
fel-terrae Lour., suku Scrophulariaceae. Hasil identifikasi dan gambar tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1 dan Lampiran 2.
4.2 Hasil Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak
Pemeriksaan karakteristik daun poguntano secara makroskopik dilakukan untuk memperoleh identitas simplisia. Hasil pemeriksaan makroskopik simplisia
daun poguntano adalah daun berwarna hijau muda sampai hijau tua, berbentuk bulat telur, tepi daun beringgit, ukuran daun ± 2 x 4 cm, dengan tekstur
permukaan daun kasar, berkerut-kerut dan berbulu. Hasil pemeriksaan makroskopik simplisia daun poguntano dapat dilihat pada Lampiran 2.
Pemeriksaan karakteristik serbuk simplisia secara mikroskopik dilakukan untuk memperoleh identitas simplisia. Hasil pemeriksaan karakteristik serbuk
simplisia secara mikroskopik pada Lampiran 3 terlihat adanya fragmen pengenal berupa trikoma, berkas pembuluh, kristal kalsium oksalat berbentuk prisma dan
stomata berbentuk diasitik dan anomositik. Menurut Depkes 2000, standarisasi suatu simplisia dan ekstrak adalah
pemenuhan terhadap persyaratan sebagai bahan obat dan menjadi penetapan nilai untuk berbagai parameter produk. Hasil pemeriksaan karakterisasi simplisia daun
poguntano dan ekstrak terlihat pada Tabel 4.1 berikut.
Universitas Sumatera Utara
