21 pekat, asam sulfat pekat, raksa II klorida, bismuth III nitrat, besi III klorida,
timbal II asetat, kalium iodida, iodium, α-naftol, asam asetat anhidrida, natrium hidroksida, amil alkohol, serbuk magnesium Mg dan kloralhidrat.
3.2 Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan adalah ikan nila sebanyak 330 ekor yang mempunyai ukuran panjang tubuh 8 – 10 cm dengan berat 2,6 ± 0,2 g, umur
sekitar 1 – 1,5 bulan. Sebelum pengujian, hewan percobaan diaklitimasi terlebih dahulu selama 14 hari dengan tujuan menyeragamkan makanan dan hidupnya
dengan kondisi yang serba sama serta menghilangkan stres akibat transportasi
sehingga dianggap memenuhi syarat penelitian.
Dua minggu sebelum pengujian dilakukan, hewan percobaan harus dipelihara dan dirawat dengan sebaik-baiknya pada akuarium yang layak dan
selalu dijaga kebersihannya. Hewan yang sehat ditandai berenang yang lincah dan aktif Depkes RI, 1979.
3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan bahan tumbuhan,
identifikasi tumbuhan dan pembuatan simplisia biji pepaya. 3.3.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan sampel yang sama dari daerah lain. Bagian tumbuhan
yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah pepaya matang yang diperoleh dari Jalan Namuterasi Pasar II Kecamatan Sei Bingei, Kabupaten Langkat,
Universitas Sumatera Utara
22 Sumatera Utara. Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah biji pepaya
dari buah pepaya matang.
3.3.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan biji pepaya Carica papaya L. dilakukan di Lembaga Ilmu Penelitian Indonesia LIPI, Bogor.
3.3.3 Pengolahan sampel
Sampel biji pepaya yang masih segar dipisahkan dari buahnya, dicuci bersih dari daging buah dan pengotoran lainnya kemudian ditiriskan lalu
ditimbang beratnya sebagai berat basah sebanyak 3,5 kg. Selanjutnya dikeringkan pada lemari pengering pada suhu
±40
o
C
hingga kering yang ditandai dengan sampel menjadi rapuh. Simplisia diblender dan ditimbang beratnya sebagai berat
kering. Diperoleh serbuk kering simplisia sebanyak 910 g dan dimasukkan ke dalam kantong plastik, diberi etiket dan disimpan di tempat yang sesuai.
3.4 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik Ditjen POM, 1995.
3.4.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan pada simplisia segar biji pepaya yang telah dicuci bersih meliputi pemeriksaan bentuk, warna, ukuran, bau dan rasa.
3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik terhadap serbuk simplisia dilakukan dengan cara meneteskan kloralhidrat di atas kaca objek, kemudian di atasnya diletakkan serbuk
simplisia, lalu ditutup dengan kaca penutup dan dilihat di bawah mikroskop.
Universitas Sumatera Utara
23 Pemeriksaan mikroskopik untuk melihat adanya butir pati dilakukan di dalam
media air.
3.5 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.5.1 Pereaksi Mayer
Sebanyak 5 g kalium iodida dalam 10 ml air suling kemudian ditambahkan larutan 1,36 g merkuri II klorida dalam 60 ml air suling. Larutan dikocok dan
ditambahkan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1995. 3.5.2 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 g bismut III nitrat dilarutkan dalam asam nitrat pekat 20 ml kemudian dicampurkan dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 g dalam 50
ml air suling. Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih diambil dan diencerkan dengan air suling secukupnya hingga 100 ml Ditjen
POM, 1995.
3.5.3 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam 20 ml air suling kemudian ditambah 2 g iodium sambil diaduk sampai larut, lalu ditambah air suling hingga
100 ml Ditjen POM, 1995.
3.5.4 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N secukupnya
hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.5.5 Pereaksi Liebermann-burchard
Sebanyak 5 bagian volume asam sulfat pekat dicampurkan dengan 50 bagian volume etanol 95. Kemudian ditambahkan dengan hati-hati 5 bagian
Universitas Sumatera Utara
24 volume asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut dan dinginkan Ditjen
POM, 1995.
3.5.6 Pereaksi Besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml kemudian disaring Ditjen POM, 1995.
3.5.7 Larutan Timbal II asetat
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.5.8 Larutan Natrium hidroksida 2N
Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes, 1979.
3.5.9 Larutan Asam klorida 2N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling sampai 100 ml Depkes, 1979.
3.5.10 Larutan Kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes, 1979.
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia dilakukan menurut Ditjen POM, 1995 dan Farnsworth 1966 untuk mengetahui golongan senyawa alkaloida, flavonoid, glikosida,
saponin, tanin dan steroidatriterpenoida.
3.6.1 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia biji pepaya ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas
Universitas Sumatera Utara
25 penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh
dipakai untuk uji alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu kedalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat.
Pada masing-masing tabung reaksi: a. ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
b. ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c. ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan di atas Ditjen POM, 1995.
3.6.2 Pemeriksaan Flavonoida
Larutan Percobaan: Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml metanol lalu direfluks selama
10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring berlipat, filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambah 5 ml eter minyak tanah, dikocok
hati-hati, didiamkan. Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40 C.
Sisa dilarutkan dalam 5 ml etil asetat, disaring. Cara Percobaan:
a. Satu ml larutan percobaan diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan dalam 1-2 ml etanol 96, ditambahkan 0,5 g serbuk seng dan 2 ml asam klorida 2 N,
didiamkan selama satu menit. Ditambahkan 10 ml asam klorida pekat, jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya
flavonoida glikosida-3-flavonol. b. Satu ml larutan percobaan diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan dalam 1
ml etanol 96, ditambahkan 0,1 g magnesium dan 10 ml asam klorida pekat,
Universitas Sumatera Utara
26 terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya
flavonoida Ditjen POM, 1995.
3.6.3 Pemeriksaan Tanin
Serbuk simplisia biji pepaya ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 3 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat
ditambahkan 1-2 tetes peraksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.
3.6.4 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk simplisia biji pepaya ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2N, direfluks
selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu
disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada
temperatur tidak lebih dari 50
٥
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan dimasukan
dalam tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch. Kemudian secara perlahan-lahan ditambahkan
2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan ikatan gula Ditjen POM, 1995.
3.6.5 Pemeriksaan Saponin
Serbuk simplisia biji pepaya ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian
dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang
Universitas Sumatera Utara
27 stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes
asam klorida 2N menunjukkan adanya saponin Ditjen POM, 1995.
3.6.6 Pemeriksaan Steroida Triterpenoida
Serbuk simplisia biji pepaya ditimbang 1 g, dimaserasi dengan 20 ml n- heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada
sisa ditambahkan beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard. Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroid, sedangkan warna merah,
merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoida Harborne, 1987.
3.7 Pembuatan Ekstrak Biji Pepaya
Pembuatan ekstrak biji pepaya sebagai pestisida nabati ini dapat dilakukan dengan cara rebusan, yaitu tepung tumbuhan ditambahkan air lalu
dipanaskandirebus. Caranya sebanyak 900 g serbuk kering biji pepaya dimasukkan ke dalam bejana tertutup, ditambahkan air sebanyak 15 L direbus
selama 20 sampai 30 menit. Didiamkan selama 24 jam lalu disaring kemudian ditambahkan air hingga diperoleh ekstrak biji pepaya sebanyak 15 L Asmaliyah,
dkk., 2010.
3.8 Tahap Persiapan Hewan Uji
Tahap persiapan ini dilakukan proses adaptasi terhadap ikan uji selama 14 hari dalam kondisi terkontrol. Selama masa tersebut ikan tersebut diberi pakan
ikan. Selama masa adaptasi terdapat lebih dari sepuluh persen ikan mati, maka dinyatakan ikan tidak layak untuk digunakan sebagai hewan percobaan Deptan,
1983.
Universitas Sumatera Utara
28
3.8.1 Uji Pendahuluan
Percobaan pada tahap pendahuluan ini bertujuan untuk mencari kisaran konsentrasi krisis bahan uji yang akan digunakan untuk penentuan LC
50
. Hewan uji sebanyak 6 kelompok. Setiap kelompok terdiri dari 10 ekor ikan dan
dimasukkan ke dalam akuarium yang berisi 15 L air dengan konsentrasi bahan uji adalah 0,1, 1, 10, 100, 1000 ppm ditambah kontrol 0 ppm.
Tabel 3.1 Konsentrasi Uji Pendahuluan
Kelompok Jumlah Ikan ekor
Konsentrasi ppm Kontrol
10 Akuarium 1
10 0,1
Akuarium 2 10
1 Akuarium 3
10 10
Akuarium 4 10
100 Akuarium 5
10 1000
Keterangan : a. kelompok Kontrol
: diberi air tawar 0 ppm b. kelompok Akuarium 1
: diberi EBP konsentrasi 0,1 ppm c. kelompok Akuarium 2
: diberi EBP konsentrasi 1 ppm d. kelompok Akuarium 3
: diberi EBP konsentrasi 10 ppm e. kelompok Akuarium 4
: diberi EBP konsentrasi 100 ppm f. kelompok Akuarium 5
: diberi EBP konsentrasi 1000 ppm Selama percobaan berlangsung hewan uji diberi makan. Pengamatan
dilakukan selama 7 hari dengan 2 kali pengulangan dan ikan yang mati dicatat. Pengujian dihentikan setelah mencapai hari ke-7. Hewan uji yang mati pada
waktu pengamatan segera dikeluarkan dari media uji untuk menghindari kemungkinan perubahan kualitas air yang bukan disebabkan oleh bahan uji.
Hewan uji diamati tiap konsentrasi dan dihitung secara kumulatif dalam tiap hari.
Universitas Sumatera Utara
29 Amati pula tingkah laku hewan uji dalam wadah yang diberi perlakuan
Rumampuk, dkk., 2010. Setelah diberikan bahan uji kemudian diamati gejala toksisitas dan dilihat
jumlah kematian hewan yang terjadi. Kemudian ditentukan konsentrasi yang akan digunakan sebagai acuan untuk melakukan penentuan LC
50
.
3.8.2 Penentuan LC
50
Konsentrasi yang digunakan pada penentuan LC
50
adalah sebagai berikut :
Tabel 3.2 Konsentrasi Penentuan LC
50
Kelompok Jumlah Ikan ekor
Konsentrasi ppm Kontrol
10 Akuarium 1
10 2
Akuarium 2 10
10 Akuarium 3
10 50
Akuarium 4 10
250 Akuarium 5
10 1250
Akuarium 6 10
6250 Keterangan :
a. kelompok kontrol : diberi air tawar 0 ppm
b. kelompok Akuarium 1 : diberi EBP konsentrasi 2 ppm
c. kelompok Akuarium 2 : diberi EBP konsentrasi 10 ppm
d. kelompok Akuarium 3 : diberi EBP konsentrasi 50 ppm
e. kelompok Akuarium 4 : diberi EBP konsentrasi 250 ppm
f. kelompok Akuarium 5 : diberi EBP konsentrasi 1250 ppm
g. kelompok Akuarium 6 : diberi EBP konsentrasi 6250 ppm
Setelah kisaran konsentrasi krisis ekstrak biji pepaya diketahui, maka dipilih tujuh konsentrasi sama dengan uji pendahuluan yaitu 2, 10, 50, 250, 1250,
6250 ppm ditambah kontrol 0 ppm. Ketujuh konsentrasi tersebut selanjutnya digunakan dalam penentuan LC
50
Abel, 1991 dalam Rumampuk, dkk., 2010.
Universitas Sumatera Utara
30 Hewan uji sebanyak 10 individu dimasukkan ke dalam setiap wadah
percobaan 7 wadah uji yang berisi 15 L air dan bahan uji dengan konsentrasi yang telah ditentukan, setiap perlakuan dan pengamatan dilakukan selama 7 hari
dengan 3 kali ulangan dan ikan yang mati dicatat. Hewan uji diamati pada tiap konsentrasi dan dihitung secara kumulatif dalam tiap hari.
3.9 Pengamatan
Pengamatan terhadap hewan uji dilakukan selama 7 hari dengan pengulangan sebanyak 3 kali. Pengamatan yang dilakukan adalah gejala toksisitas
dan kematian mortalitas hewan uji. 3.9.1 Gejala Toksisitas
Gejala keracunan pada ikan meliputi ikan mulai gelisah ditandai dengan gerakan tubuh yang tidak teratur dan bernafas dengan cepat, hilangnya
kesensitifan dimana ikan diam di dasar dan pergerakan sirip berkurang, penurunan keaktifan dimana ikan tidak respon terhadap cahaya dan sentuhan serta kondisinya
lemah, hilangnya keseimbangan ditandai sirip lumpuh, kemampuan bergerak dan melihat hilang serta hilangnya kesadaran, kehilangan keseimbangan secara total
ditandai dengan gerakan ikan yang tiba-tiba berposisi diagonal dengan kepala langsung mengarah ke permukaan, fase kematian dimana ikan mati karena
kelumpuhan organ pernafasan dan tahap terakhir adalah rigor mortis yang ditandai dengan pengerasan seluruh tubuh dan sirip Metelev, dkk., 1983.
3.9.2 Kematian Hewan
Ikan nila diamati kematiannya dari hari pertama sampai hari ketujuh.
Universitas Sumatera Utara
31
3.10 Analisa Data
Data dianalisis dengan uji One Sample T-Test untuk melihat perbedaan nyata antar perlakuan. Analisis statistik ini menggunakan program SPSS
Statistical Product and Service Solution versi 17 dengan taraf kepercayaan 95.
Universitas Sumatera Utara
32
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Tumbuhan yang telah diidentifikasi di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Indonesian Institute of Science Pusat Penelitian Biologi Research
Center for Biology, Bogor adalah Carica papaya L. suku Caricaceae. Hasil
identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 46.
4.2 Hasil Karakteristik Simplisia Biji Pepaya
Pemeriksaan karakteristik simplisia biji pepaya dilakukan secara makroskopik dan mikroskopik untuk mendapatkan identitas simplisia tersebut.
Pemeriksaan makroskopik terdiri dari pemeriksaan warna, bentuk dan rasa. Hasil pemeriksaan makroskopik biji pepaya adalah biji berwarna cokelat kehitaman
dengan permukaan sedikit kasar, berbentuk bulat lonjong, bergerigi, agak keras, berukuran 5 – 7 mm. Gambar hasil pemeriksaan makroskopik biji pepaya dapat
dilihat pada Lampiran 4, halaman 49. Pemeriksaan karakteristik serbuk simplisia secara mikroskopik terdapat
adanya kutikula, jaringan epidermis, jaringan parenkim, hablur kristal oksalat bentuk druse, berkas pembuluh xylem yang berisi butir-butir minyak. Gambar
hasil pemeriksaan mikroskopik biji pepaya dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 51.
4.3 Hasil Rebusan Biji Pepaya
Hasil ekstrak biji pepaya yang diperoleh sebanyak 15 L.
Universitas Sumatera Utara
