V
1
= Volume NaOH 0,01 M yang dibutuhkan untuk titrasi M = Berat sampel
W = Jumlah kadar air dalam bahan
3.5 Assay Aktivitas Katepsin Dinu et al. 2002
Prinsip dari analisis aktivitas katepsin, yaitu untuk mengetahui seberapa besar aktivitas enzim katepsin dalam daging ikan terkait dengan laju kemunduran
mutu ikan yang diukur melalui absorbansi pada spektrofotometer. Ikan dipreparasi untuk mendapat ekstrak kasar katepsin dengan cara ikan
dimatikan, kemudian daging ikan dibedah dengan cepat dan dicuci untuk menghilangkan darah. Jaringan daging yang diambil dari bagian punggung ikan
disuspensikan dalam akuades dengan perbandingan daging ikan dan akuades sebesar 1:1 lalu dihomogenisasi pada suhu 0-4
C. Selanjutnya ekstrak daging hasil homogenisasi ini disentrifugasi pada kecepatan 1.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan yang diperoleh kemudian disentrifugasi lagi pada kecepatan 10.000 rpm. Pelet yang dihasilkan dari hasil sentrifugasi ini kemudian dilarutkan
dalam 0,1 M buffer Tris-HCl pH 7,4 dengan jumlah yang sama seperti jumlah akuades tadi dan disentrifugasi pada kecepatan 4.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan yang diperoleh merupakan protein utama dari mitokondria dan lisosom yang siap untuk diteliti aktivitas nya lebih lanjut.
Aktivitas proteolitik dari katepsin diuji menggunakan hemoglobin terdenaturasi asam sebagai substratnya. Hemoglobin dilarutkan dalam akuades
dengan perbandingan 1:3. Kemudian pH dibuat menjadi 2,0 dengan HCl 1 N dan konsentrasi akhir hemoglobin dibuat sebesar 2 dengan akuades. Selanjutnya
1ml dari larutan substrat diinkubasi dengan 0,2 ml larutan enzim pada 47 C
selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 ml TCA 5 . Campuran disaring dan hasil reaksi yang dapat larut ditambah dengan 1 ml
pereaksi folin, serta diukur pada 750 nm. Selain itu dilakukan pula pengukuran untuk larutan blanko dan larutan standar dengan prosedur yang sama dengan
larutan sampel hanya untuk blanko dan larutan standar, enzimnya digantikan dengan akuades dan tirosin. Aktivitas enzim katepsin dapat dihitung dengan
rumus berikut : UA = Absorbansi sampel – Absorbansi blanko x P x 1T
Absorbansi standar – Absorbansi blanko Keterangan : P = Faktor pengenceran ; T = Waktu Inkubasi.
3.6 Pengukuran Konsentrasi Protein Enzim Bradford 1976
Kategori