BAB 3
BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan dari bulan Februari sampai bulan Juli 2011 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, di Laboratorium Kultur Jaringan, di Laboratorium Teknologi Pangan, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara, Medan dan di Laboratorium Pusat Penelitian
Kelapa Sawit, Medan.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang diperlukan pada penelitian ini adalah air laut, media Bushnell Haas Agar BHA yang terdiri atas KH
2
PO
4,
K
2
HPO
4
, NH
4
NO
3,
MgSO
4.
7H
2
O, FeCl
3,
CaCl
2.
2H
2
O, agar Atlas 1946, media Plat Count Agar, Roundup, akuades, dietileter, methanol, akuabides, asam fosfat, alkohol 70, desinfektan, sodium bikarbonat,
H
2
SO
4,
rhamnosa, orsinol kapas, benang wol, aluminium foil. Sedangkan alat-alat yang dipergunakan adalah tabung reaksi, cawan petri, jarum ose, bunsen, gelas beaker,
corong, corong pisah, mancis, erlenmeyer, gelas ukur, spatula, pipet volum, propipet, kertas saring, hot plate, vortex, magnetic stirer, autoklaf, oven, shaker, inkubator,
kulkas, timbangan analitik, desikator, HPLC, spektrofotometer.
3.3 Asal Isolat
Adapun isolat yang digunakan yaitu dari koleksi laboratorium, yang berasal dari Laut Tanjung Balai TJB 01 dan Sibolga SBG 05, Sumatera Utara.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Pengukuran Pertumbuhan Sel
Untuk mengetahui laju pertumbuhan dan kepadatan sel selama masa inkubasi, maka
bakteri ditumbuhkan pada media Bushnell Haas-Broth yang mengandung 2
Roundup, yang sebelumnya dilakukan pertumbuhan pada media Bushnell-Haas Agar yang mengandung 2 Roundup yang dilarutkan dengan aquadest. Sebanyak 2 ml
inokulum cair isolat bakteri yang setara dengan kekeruhan larutan Mc-Farland ≈10
8
selml komposisi larutan Mc-Farland dapat dilihat pada Lampiran A halaman 27 diinokulasikan ke dalam 20 ml media Bushnell Haas-Broth secara aseptis. Kemudian
diinkubasi pada wathebath shaker dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 30°C selama 6 hari. Pertumbuhan sel diamati setiap dua hari sekali yaitu pada hari ke-0, hari ke-2,
hari ke-4 dan hari ke-6. Pengukuran jumlah sel dilakukan dengan metode Standart Plate Count Fardiaz, 1992. Sebanyak 1 ml media biakan diencerkan hingga
konsentrasi 10
-8
atau 10
-12
, kemudian diinokulasikan ke media Plate Count Agar dengan metode cawan sebar dan diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni yang
tumbuh dihitung. Untuk perhitungan estimasi jumlah sel dapat dihitung dengan rumus:
Estimasi Jumlah Sel = Jumlah koloni x
enceran faktorPeng
1
CFUml Alur kerja estimasi jumlah sel Isolat bakteri dengan metode SPC dapat dilihat pada
Lampiran B halaman 28.
3.4.2 Uji Potensi Bakteri Dalam Memproduksi Biosurfaktan 3.4.2.1 Penentuan Kurva Standar Rhamnosa
Kurva standar rhamnosa dibuat dengan menggunakan biosurfaktan murni dari jenis rhamnosa yang diperoleh dari Sigma Aldrich Company, Amerika Serikat. Rhamnosa
dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda yang dilarutkan dengan larutan sodium bikarbonat NaHCO
3
0,05M. Rhamnosa dibuat dengan konsentrasi 0 blanko, 10, 50, 100 dan 200 ppm, kemudian masing-masing larutan tersebut ditambah 3,6 ml
Universitas Sumatera Utara
larutan orsinol, dipanaskan hingga mendidih, didinginkan pada temperatur kamar selama 15 menit dan dianalisa dengan spektrofotometer UV-Visibel Shimadzu 1240
pada panjang gelombang 421 nm Chandrasekaran and Be Miller, 1980; Koch et al., 1991 dalam Warsito, 2009. Persamaan garis regresi kurva standar rhamnosa
ditentukan dengan metode Least Square Glover and Mitchell, 2002 dalam Warsito, 2009 dengan rumus:
Y= a + bX Dimana: a= intersep
a=
Y
- b
X
b= slope koefisien regresi b =
2 2
X X
n Y
X XY
n ∑
− ∑
∑ ∑
− ∑
Y= absorbansi X= konservasi
Alur kerja penentuan kurva standar rhamnosa dapat dilihat Lampiran C halaman 29.
3.4.2.2 Produksi Biosurfaktan dan Kuantitatif
Sebanyak 2 ml inokulum cair isolat bakteri yang setara dengan larutan Mc-Farland diinokulasikan ke dalam media Bushnell- Haas Broth yang mengandung 2 Roundup
secara aseptis. Kemudian diinkubasi pada watherbath shaker dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 30°C. Konsentrasi biosurfaktan yang dihasilkan diamati setiap 2 hari
selama 6 hari.
Konsentrasi biosurfaktan yang terbentuk dianalisa dengan metode orsinol yang dimodifikasi Chandrasekaran and Be Miller, 1980; Koch et al., 1991. Media cair
hasil inkubasi disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan media biakan dengan bakterinya dan diambil supernatannya. Sebanyak 4
ml supernatan diekstrak dengan 2 ml diethylether selama 5 menit, ekstraksi diulangi 3 kali. Lapisan ether diambil, dikeringkan dan dilarutkan kembali dalam 2 ml sodium
bikarbonat 0,05 M. Kemudian larutan sampel tersebut divorteks dan ditambah 3,6 ml larutan orsinol, dipanaskan hingga mendidih, didinginkan pada temperatur kamar
selama 15 menit dan dianalisa dengan spektrofotometer UV-Visibel Shimadzu 1240
Universitas Sumatera Utara
pada panjang gelombang 421 nm. Konsentrasi biosurfaktan dihitung dengan menggunakan kurva standar rhamnosa dan diekspresikan dalam satuan ppm. Alur
kerja produksi biosurfaktan dan kuantitatif dapat dilihat pada Lampiran D halaman 30.
3.4.3 Analisis Kuantitatif Residu dari Glifosat 3.4.3.1 Penentuan Kurva Standar Glifosat
Untuk membuat kurva standar glifosat, maka terlebih dahulu dibuat larutan standar glifosat dengan konsentrasi 1.000, 2.000, 3.000, 4.000 dan 5.000 ppm. Glifosat
ditimbang sebanyak 0,1 g kemudian dilarutkan dengan eluent Buffer fosfat. Masing-masing larutan glifosat dengan konsentrasi tersebut diinjeksikan sebanyak 10
μl ke dalam HPLC. Hasil analisa glifosat akan diperoleh dalam satuan luas area. Setelah diperoleh luas area dari masing-masing konsentrasi glifosat, dibuat kurva
standar glifosat dengan memplot konsentrasi versus luas area. Dari kurva dibuat persamaan garis lurus metode Least square Glover and Mitcell, 2002. Sehingga
diperoleh persamaan: Y= a + bX
Dimana: Y = Luas area X = Konsentrasi glifosat ppm
a = intersep b = slope
Alur kerja penentuan kurva standar glifosat dapat dilihat pada Lampiran E halaman 31.
3.4.3.2 Analisis Glifosat Sisa Dilakukan dengan Metode HPLC High performance liquid chromatography
Sebanyak 2 ml inokulum cair isolat bakteri yang setara dengan kekeruhan larutan standar Mc-Farland
≈10
8
selml diinokulasikan ke media Bushnell-Haas Broth yang mengandung 2 Roundup secara aseptis. Kemudian biakan cair isolat bakteri
diinkubasi pada watherbath shaker dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 30°C selama
Universitas Sumatera Utara
6 hari. Sebagai kontrol, media Bushnell-Haas Broth yang mengandung 2 Roundup dibuat tanpa ada inokulum. Setelah 6 hari masa inkubasi, media kemudian disaring
dengan kertas saring dan diambil filtratnya. Filtrat ditambahkan metanol 960:40 dan eluent Buffer fosfat, kemudian diekstraksi. Kadar glifosat sisa degradasi dianalisa
dengan HPLC. Sebanyak 10 μl diinjeksikan ke dalam HPLC sehingga diperoleh nilai
luas area dari masing-masing sampel. Nilai luas area dari masing-masing sampel disubstitusikan ke persamaan kurva standar glifosat sehingga diperoleh nilai
konsentrasi glifosat tersisa dari masing-masing sampel. Analisa glifosat dilakukan di laboratorium Rispa. Alur kerja analisa glifosat sisa dengan metode HPLC dapat dilihat
pada Lampiran F halaman 32.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pertumbuhan Isolat
Pertumbuhan isolat bakteri penghasil biosurfaktan dari laut Tanjung Balai TJB 01 dan Sibolga SBG, Sumatera Utara selama masa inkubasi 6 hari yang dihitung
berdasarkan jumlah koloni pada media Plate Count Agar seperti terlihat pada tabel berikut:
Tabel 4.1 Laju pertumbuhan rata-rata isolat bakteri pengahasil biosurfaktan asal laut Tanjung Balai dan Sibolga, Sumatera Utara
Isolat Jumlah sel CFUml
Hari ke-0 Hari ke-2
Hari ke-4 Hari ke-6
TJB 01 1 × 10
8
105 × 10
8
33 × 10
10
6,3 × 10
12
SBG 05 1 × 10
8
70,3 × 10
8
71 × 10
10
1,6 × 10
12
Dari hasil yang diperoleh diketahui bahwa kedua jenis isolat menunjukkan peningkatan pertumbuhan sampai hari ke-6. Dari kedua isolat menunjukkan pola
pertumbuhan yang sama. Pada Tabel 4.1 menunjukkan bahwa pada hari ke-2 pertumbuhan sel yang tinggi ditunjukkan oleh isolat TJB 01 yaitu sebesar 105 × 10
8
CFUml. Namun pada hari ke-4 pertumbuhan isolat SBG 05 lebih tinggi dari pada isolat TJB 01 yaitu sebesar 71 × 10
10
. Sedangkan pada hari ke-6 pertumbuhan tertinggi juga pada isolat TJB 01. Pada Gambar 4.1 dapat dilihat histogram
pertumbuhan isolat TJB 01 dan SBG 05 selama masa inkubasi 6 hari.
TJB 01 : Tanjung Balai SBG 05 : Sibolga
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.1 Pertumbuhan isolat TJB 01 dan SBG 05 selama 6 hari
Dari Gambar 4.1 terlihat bahwa pertumbuhan isolat bakteri TJB 01 dan SBG 05 semakin meningkat sampai hari ke-6 walaupun peningkatan antara kedua isolat
seimbang. Hal ini diduga karena dari kedua isolat mampu memanfaatkan glifosat sebagai sumber karbon dan energi.
Menurut Kishore and Jacob 1987, bahwa glifosat digunakan oleh Pseudomonas sp. sebagai sumber karbon dan energi untuk proses metabolisme.
Sedangkan menurut Moneke et al., 2010, glifosat juga digunakan sebagai sumber fosfor yang terbaik untuk pertumbuhan bakteri. Menurut Moore et al., 1983,
Pseudomonas aeruginosa memanfaatkan glifosat, salah satu herbisida
organophosphonat [N phosphonomethylglycine] sebagai sumber fosfor dan sebagian dari bakteri mampu memanfaatkan aminomethylphosponat yang diperoleh dari
glifosat sebagai sumber fosfor untuk pertumbuhan dengan kemampuan yang lambat.
4.2 Pengukuran Produksi Biosurfaktan