Ekstraksi Perlakuan pH Simulasi Sistem Pencernaan Pengujian

III. METODOLOGI PENELITIAN

A. Alat dan Bahan

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah teh hijau yang diperoleh dari PT Perkebunan Nusantara Gunung Mas di Bogor. Bahan-bahan yang digunakan dalam analisis daya inhibisi enzim alfa-amilase antara lain: pati murni Merck, enzim alfa-amilase pancreatic porcine Sigma A3176, pereaksi asam 3,5 – dinitrosalisilat DNS, larutan stok maltosa standar, dan buffer natrium fosfat pH 6.9. Bahan-bahan yang digunakan untuk mengukur kadar tanin antara lain : aquades, HCl 32, dan formalin HCHO 27. Bahan-bahan yang digunakan dalam analisis daya inhibisi enzim alfa-glukosidase antara lain: enzim alfa-glukosidase dari Saccharomyces cerevisiae tipe I Sigma G5003, larutan p-nitrofenil- α-D glukofuranosida Sigma N1377, buffer kalium fosfat pH 6.8, dan Na 2 CO 3 . Bahan-bahan yang digunakan untuk mengukur total fenol adalah etanol 95, pereaksi Folin Ciocalteau 50, Na 2 CO 3 5 , dan larutan asam galat. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer, sentrifugasi, neraca analitik, gelas piala, tabung reaksi, tabung reaksi bertutup, kuvet, alat vortex, pipet, penangas air, gelas ukur, neraca analitik, alumunium foil, termometer, inkubator, sudip, gelas pengaduk, gelas arloji, dan saringan, sikat.

B. Metode Penelitian

Tahap penelitian dilakukan seperti pada Gambar 3. Penelitian pertama-tama dilakukan dengan menyeduh bubuk teh hijau dengan menggunakan suhu air dan lama penyeduhan yang berbeda. Ekstrak teh hijau yang didapat dari penyeduhan kemudian diberi dua perlakuan yang berbeda, yaitu ada yang diberi perlakuan pengaturan simulasi pH pencernaan dan ada yang tanpa diberi perlakuan disebut ekstrak awal. Ekstrak yang dibiarkan seperti ekstrak awal langsung dilakukan beberapa uji, yaitu pengukuran pH, inhibisi enzim alfa amilase, inhibisi enzim alfa glukosidase, total fenol, dan kadar tanin. Ekstrak awal yang diberi pengaturan simulasi pH pencernaan pertama-tama diubah pH nya seperti pH lambung pH 2 dan didiamkan selama 30 menit kemudian dinaikkan menjadi pH 6.8 seperti pH pada usus halus. Ekstrak tersebut diuji daya inhibisinya terhadap enzim alfa amilase dan alfa glukosidase.

1. Ekstraksi

Sampel teh yang digunakan merupakan sampel yang didapat langsung dari industri pengolahan teh sehingga diharapkan teh ini masih memiliki kualitas yang baik karena tidak melalui proses distribusi yang panjang atau penyimpanan yang terlalu lama. Teh hijau yang diuji memiliki konsentrasi yang sama, yaitu 0.04 gml 4 gram teh ditambahkan dengan 100 ml air. Teh hijau diuji berdasarkan perbedaan suhu dan lamanya waktu menyeduh teh. Teh hijau diuji dengan perbedaan suhu yaitu sebesar 70 o dan 100 o C dan juga perbedaan waktu yaitu sebesar 5, 15, dan 30 menit. Diagram alir ekstraksi teh dapat dilihat pada Lampiran 1.

2. Perlakuan pH Simulasi Sistem Pencernaan

Pada percobaan ini, kondisi keasaman ekstrak teh hijau yang digunakan adalah pada pH awal produk dan pada pH usus halus. Ekstrak teh hijau pertama-tama diukur pH-nya sehingga didapatkan pH ekstrak awal. Penepatan pH usus halus ini dilakukan dengan terlebih dahulu menepatkan pH menjadi 2 dengan menggunakan kurang lebih tiga sampai empat tetes HCl 11.96 N dan ditunggu kurang lebih tiga puluh menit dan kemudian pH ditepatkan kembali menjadi 6,8-7 11 dengan menggunakan NaOH 10 N sebanyak lima sampai tujuh tetes. sehingga didapatkan kondisi keasaman seperti keadaan pH usus halus manusia. Kondisi ini dilakukan agar dapat menyerupai kondisi pencernaan manusia pada umumnya.

3. Pengujian

Pengujian daya inhibisi enzim alfa-amilase dan alfa-glukosidase yang dilakukan baik pada ekstrak dengan pH awal maupun pH usus halus 6.8 setelah melalui pH lambung pH 2 selama 30 menit. Kadar total fenol, pH dengan menggunakan pH-meter, dan kadar tanin juga diukur pada ekstrak awal. A Pengujian inhibisi enzim alfa-amilase Thalapaneni et al. 2008 Pada penelitian ini ingin diketahui pengaruh masing-masing konsentrasi teh hijau terhadap penurunan aktivitas enzim alfa amilase dalam memecah pati sehingga hasilnya adalah penurunan daya cerna pati.Enzim alfa amilase akan menghidrolisis pati menjadi gula-gula Teh Hijau Ekstraksi penyeduhan 4 gram teh hijau dalam 100 ml air pada suhu awal 70 o C dan 100 o C selama 5, 15, dan 30 menit Pengukuran inhibisi alfa amilase Pengukuran inhibisi alfa glukosidase Pengukuran pH Pengukuran inhibisi alfa amilase Pengukuran inhibisi alfa glukosidase Pengukuran total fenol Pengukuran kadar tanin Ekstrak Teh Hijau Pengaturan simulasi pH pencernaan pH 2 selama 30 menit kemudian pH 6.8 Gambar 3. Diagram alir penelitian 12 sederhana. Semakin banyak gula-gula sederhana seperti glukosa dan maltosa yang dihasilkan dari proses hidrolisis pati, hal ini menggambarkan semakin tingginya daya cerna pati. Glukosa dan maltosa dapat bereaksi dengan DNS asam dinitrosalisilat sehingga kadar keduanya dapat diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 540 nm. B Pengujian inhibisi enzim alfa-glukosidase Mayur et al. 2010 Pada penelitian ini enzim alfa-glukosidase yang digunakan berasal Saccharomyces cerevisiae tipe I. Aktifitas penghambatan enzim alfa-glukosidase dilakukan secara in vitro dengan melihat pemecahan substrat p-nitrofenil- α-D-glukofiranosa menjadi p-nitrofenil yang berwarna kuning dan glukosa. Aktifitas penghambatan enzim diukur berdasrkan jumlah p- nitrofenil yang dihasilkan dengan mengukur nilai absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm. C Pengujian kadar total fenol Strycharz dan Shetty 2002 dengan modifikasi diacu Zega 2010 Analisis kadar total fenol dilakukan dengan menggunakan reagen folin-ciocelteau. Pengukuran dilakukan dengan cara melihat kemampuan reduksi dari komponen fenol dengan standar yang digunakan adalah asam galat. Prinsip dari metode ini adalah reduksi dari reagen fosfomolibdat MoO 4 2- dan fosfotungstat WO 4 2- sehingga terbentuk kompleks warna biru yang dapat terukur secara spektrofotometri sinar tampak. Pengukuran dilkukan pada panjang gelombang 725 nm. D Pengukuran kadar tanin Nugraha 1999 Percobaan ini dilakukan untuk mengetahui kadar tanin yang ada pada sampel, yaitu ekstrak teh hijau. Pengukuran kadar tanin ini di lakukan dengan metode gravimetri. Menurut Ummah 2010 reaksi yang terjadi didasarkan pada kereaktifan struktur flavonoid dari tanin terkondensasi terhadap formaldehida. Hasil dari reaksi ini akan membentuk endapan sehingga secara kualitatif dapat diketahui adanya tanin terkondensasi. E Analisis

1. Inhibisi Enzim Alfa Amilase Thalapaneni et al. 2008