Seleksi B. thuringiensis Determination of C N Ratio and development of Bioinsecticide Production by Bacillus thuringiensis Using Tofu waste Cultivation Media

mm dan berwarna putih. Di bawah pengamatan mikroskop sel vegetatifnya berbentuk batang Gambar 8. B1 B2 B3 Gambar 8 Sel vegetatif B. thuringiensis koloni tidak bertitik B1, koloni bertitik B2, koloni dari ulat B3 dengan perbesaran 400x Pada Gambar 9 ditunjukan bahwa B. thuringiensis dapat membentuk spora S selama fase stasioner dalam daur hidupnya Schnepf et al. 1998. Ciri yang membedakan B. thuringiensis dengan spesies bacillus yang lain adalah kemampuan menghasilkan badan inklusi parasporal berupa kristal protein yang dapat diamati dibawah mikroskop fase kontras. Morfologi, ukuran, dan jumlah protein kristal sangat bervariasi pada setiap galur B. thuringiensis Apaydin 2004; Xavier et al. 2010. Masing-masing morfologi protein kristal dikode oleh gen Cry gen dan gen Cyt . Ada lima jenis morfologi kristal protein yang masing-masing dikode oleh gen yang berbeda pula: kristal bipiramid berhubungan dengan protein Cry1; kristal kubus berhubungan dengan protein Cry2; kristal bulat dan komposit berhubungan dengan protein Cry4 dan protein Cyt; kristal persegi berhubungan dengan protein Cry3; Kristal berbentuk batang berhubungan dengan protein Cry4D Lopez-Meza dan Ibra, 1996; Schnepf et al. 1998. B1 B2 B3 Gambar 9 Hasil pengamatan koloni tidak bertitik B1, koloni bertitik B2, koloni dari ulat B3 dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000x. bakteri B, spora S, kristal protein C Pengamatan dibawah Scanning Electron Microscopy SEM menunjukkan koloni B1 dan koloni B2 dari culture collection serta koloni B3 dari ulat mengandung kristal protein berbentuk kubus, bipiramid dan bulat Gambar 10. Menurut Bideshi et al. 2010, gen Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac merupakan penyusun kristal protein berbentuk bipiramida, sedangkan Cry2Aa penyusun kristal protein berbentuk kubus. Masing-masing kristal protein memiliki daya toksisitas terhadap Lepidoptera. Sedangkan menurut Frederici et al. 2010 kristal C S B C S B C S B protein berbentuk bulat dikode oleh gen Cyt1Aa dan mempunyai daya toksisitas terhadap Diptera. B1 B2 B3 Gambar 10 B. thuringiensis diamati di bawah SEM koloni tidak bertitik B1, koloni bertitik B2, koloni dari ulat B3, dimana B: sel vegetatif, S: spora, dan C: kristal protein

4.3 Pengaruh Media Kultivasi

4.3.1 Jumlah sel hidup

Menurut Tirado-Montiel et al. 2001, ketersediaan sumber karbon dan nitrogen dapat mempengaruhi yield sel hidup, spora dan kristal protein dalam proses kultivasi B. thuringiensis. Ketika nutrisi dan kondisi lingkungan mendukung untuk pertumbuhan bakteri, spora tumbuh menjadi sel vegetatif dan berkembang biak dengan cara membelah diri. Jumlah sel hidup menunjukan total jumlah sel vegetatif, spora yang sedang tumbuh dan jumlah spora Bideshi et al. 2010. C C C S S S B B C C C B C C Secara umum pertumbuhan ketiga koloni B. thuringiensis dalam media NB maupun LCT dapat berkembang dengan baik. Berdasarkan hasil Total Plate Count TPC, rata-rata jumlah sel hidup ketiga koloni B. thuringiensis dalam media NB lebih banyak dibanding media LCT, hal ini karena NB merupakan media yang mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba. NB dibuat dari ekstrak sapi yang mengandung basa organik dan pepton yaitu produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, gelatin dan kedelai Tabel 9, untuk pepton yang terbuat dari ikan mengandung protein yang cukup tinggi hingga 74,17 Saputra 2008. Selain itu terdapat pula yeast extract yang kaya akan vitamin, mineral dan asam nukleat. Komponen yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel vegetatif Bt sangat mencukupi dalam NB. Tabel 9 Komposisi bahan penyusun nutrient broth Hal sebaliknya terjadi dalam media LCT, dimana terdapat penurunan pertumbuhan jumlah sel hidup karena sangat berkaitan dengan ketersediaan sumber karbon dan nitrogen di dalam media tersebut yang lebih terbatas dibanding NB. Sel dapat tumbuh dalam media LCT karena mengkonsumsi karbon dan nitrogen yang berasal dari protein dan gula-gula sederhana yang terlarut. Selanjutnya, pengaruh galur B. thuringiensis terhadap jumlah sel hidup juga memperlihatkan hasil yang bervariasi. Galur B2 dalam kedua media dapat tumbuh lebih baik dibanding dengan kedua galur yang lain, dimana jumlah total koloni hidup sebesar 7,45 x 10 7 cfuml pada media NB dan 3,95 x 10 7 cfuml pada media LCT Gambar 11. Galur B3 menunjukan perbedaan jumlah sel hidup yang sangat berbeda jauh dalam kedua media, masing-masing 5,65 x 10 7 cfuml pada media NB dan 1,33 x 10 7 cfuml pada media LCT. Ini dapat terjadi kemungkinan karena sifat adaptasi B3 yang kurang baik pada media yang memiliki keterbatasan jumlah karbon dan nitrogen. Komponen Komposisi gL Meat extract 1,0 Pepton 5,0 Yeast extract 2,0 Natrium Klorida 5,0 HiMedia laboratories 2010