3 METODE PENELITIAN
3.1 Kerangka Pemikiran
Keberhasilan produksi bioinsektisida selain dipengaruhi oleh galur bakterinya, juga dipengaruhi oleh media dan kondisi fermentasi yang digunakan.
Untuk memperoleh komplek spora - kristal yang optimum diperlukan kesesuaian nutrisi dan galur Bt yang digunakan. Nilai parameter terbaik untuk suatu galur
tidak sama dengan galur yang lain, tetapi secara umum kondisi kultivasi harus dioptimalkan untuk memperoleh jumlah spora yang banyak, konsentrasi protein
kristal yang tinggi dan daya toksisitas yang tinggi pula Dulmage et. al. 1990. Dalam kultivasi B. thuringiensis, karbon mempunyai peran yang sangat penting.
Konsentrasi karbon yang tinggi menyebabkan B. thuringiensis menghasilkan asam sehingga terjadi penurunan pH di bawah 5,5 – 5,7 dimana pada kondisi ini
kebanyakan galur B. thuringiensis tidak dapat tumbuh sehingga fermentasi terhenti Dulmage et al. 1990. Sebaliknya, efek kenaikan pH akan terjadi apabila
konsentrasi nitrogen dalam media cukup tinggu. Untuk menjaga kondisi ini diperlukan keseimbangan perbandingan karbon – nitrogen dan pH dikontrol
dengan cara menambahkan buffer selama proses. Farrera et al. 1998 menjelaskan bahwa keseimbangan rasio CN secara langsung berpengaruh pada
produksi kristal protein. Komponen lain yang sangat penting dalam produksi protein kristal adalah kalsium. Kultivasi B. thuringiensis pada media yang
mengandung garam kalsium akan menghasilkan peningkatan produksi protein kristal. Untuk menguji aktivitas bioinsektisida komplek spora-kristal protein dari
Bt dapat diukur melalui bioassay yaitu metode pengujian insektisida mikrobial yang didesain untuk menentukan berapa banyak bahan yang diperlukan untuk
menyebabkan kematian populasi serangga sasaran. Dalam penggandaan skala diperlukan penerapan kondisi terbaik
berdasarkan suatu acuan tertentu. Acuan yang umum digunakan adalah berbasis tenaga per volume PgV tetap atau berdasarkan koefisien transfer oksigen Kl
a
konstan. Kultivasi dengan media limbah cair tahu yang memiliki partikel kasar cukup menyulitkan pengontrolan Kl
a
, sehingga basis PgV menjadi pilihan yang dapat dilakukan.
Gambar 6
Diagram alir tahapan penelitian
Gambar 6 Diagram alir penelitian
Analisa Komposisi Media
Kadar air,abu, protein, lemak, serat kasar, karbohidrat, C total, N total
Seleksi B. thuringiensis
Sumber Bakteri
dari culture collection dan ulat sutra Parameter yang dianalisa : jumlah sel hidup N, jumlah spora hidup P,
penampakan mikroskopik, daya toksisitas terhadap C.binotalis Daya toksisitas terhadap C.binotalis
Persiapan Inokulum
Penyegaran di agar miring, pembiakan dalam Nutrient Broth, pembiakan dalam limbah cair tahu
Penentuan CN Rasio pada Kultivasi Skala Laboratorium 500 ml
Parameter yang dianalisa pada jam pengamatan ke 0,3,6,9,12,24,36,48, 72: pH, jumlah sel hidup N, jumlah spora hidup P, jumlah substrat sisa
S, pertumbuhan spesifik maksimum µ
x
-maks., efisiensi penggunaan substrat, konversi substrat menjadi biomassa Y
NS
, konversi substrat menjadi produk Y
PS
, dan konversi substrat menjadi biomassa Y
XS
Kultivasi Skala Laboratorium 3 liter
Parameter yang dianalisa pada jam pengamatan ke 0,3,6,9,12,24,36,48, 72 : pH, jumlah sel hidup N, jumlah spora hidup P, jumlah substrat sisa
S, laju pertumbuhan spesifik µ, Y
NS
, Y
PS
, Y
XS
, Penentuan Tenaga per unit Volume PgV dan daya toksisitas terhadap C.binotalis
Karakterisasi Bioinsektisida
Pola Protein dengan SDS-PAGE, Kadar asam amino
Kultivasi Skala Laboratorium 40 liter
Parameter yang dianalisa pada jam pengamatan ke 0,3,6,9,12,24,36,48,: pH, jumlah sel hidup N, jumlah spora hidup P, jumlah substrat sisa S,
laju pertumbuhan spesifik µ, Y
NS,
Y
PS,
Y
XS
, Penentuan Tenaga per unit Volume PgV dan daya toksisitas terhadap C.binotalis
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
