Prosedur Kerja METODE PENELITIAN

44 5. Tahap Pelaksanaan a. Pemberian ekstrak biji pepaya Ekstrak biji pepaya diberikan secara oral pada tikus perlakuan sesuai dosisnya masing-masing dan diberikan setiap 1 hari sekali sebelum makan pada pagi menjelang siang hari selama 21 hari. b. Pemeliharaan dengan pemberian pakan pellet AD 1 secara rutin. c. Ulas vagina dilakukan pada awal sebelum pemberian ekstrak dan setelah selesai pemeberian ekstrak pada hari ke-22 untuk mengetahui siklus estrusnya. Salah satu cara untuk mengetahui siklus estrus tikus putih betina dengan cara ulas vagina, adapun prosedur pembuatan ulas vagina adalah gelas benda dibersihkan dengan alkohol 70. Cotton bud dicelupkan ke dalam NaCl fisiologis, kemudian dimasukkan ke dalam vagina tikus sedalam 1 cm kemudian diputar secara merata dan perlahan-lahan sehingga diperoleh jaringan mukosa vagina. Cotton bud yang mengandung mukosa vagina selanjutnya dioleskan di atas gelas obyek sambil diputar sehingga diperoleh olesan yang merata. Gelas obyek kemudian dikering anginkan di udara kemudian difiksasi dengan methanol 70 selama 15 menit. Sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan pada suhu kamar. Sediaan ulas vagina kemudian ditetesi dengan cat gymsa selama 5 menit dan dicuci dengan air mengalir kemudian diamati di bawah mikroskop. Penentuan fase siklus estrus dilakukan berdasarkan keberadaan jumlah sel-sel epitelnya. 45 d. Pengamatan jumlah sel darah merah dan putih pengambilan sel darah dari tikus tersebut dengan meggunakan pipa hematokrit, di bagian vena orbitalis sebanyak 1 ml, dan meletakkan di atas hemositometer kemudian meneteskan dengan dengan Hayem untuk mengecek jumlah eritrosit dan meneteskan dengan Turk untuk mengecek jumlah lekosit tikus putih. 1 Penghitungan Jumlah Eritrosit dan Lekosit Cara penghitungan jumlah eritrosit dan lekosit dengan cara sampling sebagai berikut Nurcahyo, 2003: 31,38. a Mengambil darah yang ada dalam mikrotube dengan pipet khusus sampai tanda 0,5 kemudian membersihkan ujung pipet dengan kertas tissue. Hisap reagent hayem sampai tanda 101 jangan sampai ada gelembung udara, kemudian pipet digoyangkan perlahan sampai homogen. b Menyiapkan bilik hitung haemacytometer. c Dua tetes pertama larutan darah dalam pipet tersebut dibuang terlebih dahulu, lalu meneteskan dalam pipet ke haemacytometer yang telah diletakkan gelas penutup di atasnya lewat tepi sampai merata. d Darah yang sudah ada dalam haemacytometer diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran lensa objektif 100x dilihat pada layar monitor. e Jumlah sel darah merah yang terhitung dimasukkan dalam rumus sebagai berikut: 46 Keterangan: Angka 10 berasal dari dalamnya pipet 0,1 mm dijadikan 1 mm 10 kali Angka 5 berasal dari 15 dari 1 mm3 25 kotak Angka 200 berasal dari pengenceran 200 kali 0,5 menjadi 101 Penghitungan sel darah putih, sama halnya dengan langkah kerja pada penghitungan sel darah merah. Reagent yang digunakan adalah reagent turk dan pipet khusus yang digunakan bertanda khusus 11. Perhitungan dilakukan pada 5 kotak besar haemocytometer dan jumlahnya dihitung denganrumus: Keterangan: Jumah SDP a Jumlah rata-rata kotak b Angka 20 berasal dari pengenceran 0,5 menjadi 11 20 kali Angka 10 berasal dari kedalaman parit 0,1 mm menjadi 1 mm Angka 4 berasal dari kotakan mestinya hanya 1 kamar e. Melakukan pembedahan dan pembuatan preparat Pembedahan dan pembuatan preparat organ uterus yang di dalamnya mencakup kelenjar endometrium, dan pembuatan preparat eritrosit dan lekosit. f. Pembuatan preparat histologi. Pembedahan dilakukan terhadap tikus pada hari ke 22 pada saat fase estrus kemudian pengambilan organ uterus, kemudian direndam dalam Jumlah SDM = SDM yang dihitung x 10 x 5 x 200 mm3 Jumlah SDP = ax20x104 mm3 47 formalin 10 . Pembuatan preparat dilakukan di Fakultas Kedokteran UGM dengan cara kerja sebagai berikut: 1 Fixation yang telah dilabeli dimasukkan kedalam fixative, yaitu formalin 10. 2 Trimming Triming adalah tahapan yang dilakukan setelah proses fiksasi dengan melakukan pemotongan tipis jaringan setebal kurang lebih 4 mm. 3 Dehydration Pengeringan Dehidrasi jaringan dimaksudkan untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam jaringan, dengan meggunakan cairan dehidran yaitu alkohol secara bertingkat dengan waktu yang tertentu yaitu a Alkohol 80, dilakukan 2 jam perendaman b Alkohol 96, dilakukan 2 jam perendaman c Alkohol 96, dilakukan 1 jam perendaman d Alkohol absolut, dilakukan 1 jam perendaman e Alkohol absolut, dilakukan 1 jam perendaman f Alkohol absolut, dilakukan 1 jam perendaman 4 Clearing Penjernihan Proses ini bertujuan untuk menghilangkan alkohol, agar parafin dapat masuk ke dalam jaringan. Agen penjernihan adalah Xylol dengan cara bertahap yaitu : a Xylol, dilakukan 1 jam perendaman b Xylol, dilakukan 1 jam perendaman 48 c Xylol, dilakukan 1 jam perendaman 5 Parafination Proses infiltrasi dilakukan didalam oven incubactor dengan perbandingan xilol : paraffin = 1:1 selama 120 menit pada suhu 60 C. Pemberian paraffin murni dilakukan selanjutnya pada suhu 60 C selama 120 menit kemudian dilanjutkan pemberian paraffin murni pada suhu 60 C selama 120 menit. 6 Embeddingi Penanaman Jaringan berada pada parafin kemudian dilekatkan pada balok kayu ukuran 3x3 cm atau embedding cassette. Fungsi dari balok kayu atau embedding cassette adalah untuk pemegang pada saat blok dipotong dengan mikrotom. 7 Sectioning pemotongan menggunakan mikrotom a Blok parafin yang telah berisi jaringan, diiris menggunakan scalpel sehingga bagian yang akan diiris dengan pisau mikrotom berbentuk segiempat teratur. Preparat diletak ditengah, kira-kira 3-5 mm dari tepinya. b Meletakkan blok parafin pada holder kayu. c Memasang holder dengan blok paraffin pada rotary mikrotom yang direkatkan. d Menyiapkan tempat coupes atau pita preparat dan kuas kecil untuk mengambil coupes dari pisau mikrotom. 49 e Mengatur tebal tipisnya coupes dengan mengatur pada pengaturan di mikrotom. f Memasukkan preparat ke dalam nampan yang berisi air hangat. Hal tersebut dilakukan agar coupes dapat merentang dan jaringan tidak melipat. g Menempelkan coupes pada gelas benda pada proses affixing yang sebelumnya telah diolesi oleh putih telur atau albumin. 8 Affixing a Meletakkan sejumlah coupes irisan tengah pita preparat pada kaca benda yang telah diberi perekat dengan gliserin dan albumin. b Memindahkan kaca-kaca gelas benda yang berisi coupes tersebut keatas hot plate dengan suhu 40-45°C, adanya kelebihan air dihisap dengan menggunakan pipetkertas saring, dan mengarur letak coupes dengan parafinnya direntangkan. 9 Pewarnaan menggunakan Hematoxylin-Eosin a Mencelupkan kaca benda yang telah ditempeli coupes ke dalam xylol secara berulang yaitu : Xylol I selama 5 menit Xylol II selama 5 menit Xylol III selama 5 menit b Melakukan dehidrasi berulang yakni: Alkohol absolut I selama 5 menit Alkohol absolut II selama 5 menit 50 c Mencelupkan coupes kedalam aquadest selama 1 menit d Mencelupkan kedalam Harris-Hematoxyilin selama 20 menit e Mencelupkan coupes kedalam aquadest selama 1 menit f Mencelupkan coupes kedalam acid alkohol sebanyak 2-3 celupan g Mencelupkan coupes kedalam aquadest selama 1 menit h Mencelupkan coupes kedalam aquadest selama 15 menit i Kemudian mencelupkan kedalam Eosin selama 2 menit j Melakukan dehidrasi berulang lagi yakni: Alkohol 96 I selama 3 menit Alkohol 96 I selama 3 menit Alkohol absolut III selama 3 menit Alkohol absolut IV selama 3 menit k Mecelupkan kedalam Xylol yaitu : Xylol IV selama 5 menit Xylol V selama 5 menit l Memounting dengan permount. g. Pengamatan struktur histologik Preparat yang telah dibuat di amati dan dihidung dengan cara sampling dibawah mikroskop per satuan lapang pandang pada struktur penampang melintang uterus dengan perbesaran objektif 10x dilihat pada layar monitor dan diamati seluruh lapang pandang preparat histologik kelenjar endometrium, kemudian dibandingkan antara preparat perlakuan dan kontrol. Pengambilan gambar preparat menggunakan optilab. 51

K. Metode Pengumpulan Data

Metode ini dilakukan dengan memberi perlakuan konsentrasi ekstrak biji pepaya 0, 300, 350, dan 400 mgtikushari untuk uji definitif, setelah dilakukannya uji pendahuluan, yang diberikan dengan cara dicekokkan pada hewan uji coba, untuk melihat jumlah kelenjar endometrium yang ada pada struktur struktur histologik endometrium tikus putih Rattus norvegicus betina per satuan lapang pandang pada struktur penampang melintang uterus dengan perbesaran lensa objektif 10x dilihat pada layar monitor, yang belum pernah bunting, juga untuk melihat jumlah sel eritrosit dan lekosit tikus putih Rattus norvegicus betina yang belum pernah bunting. Penelitian diakhiri setelah hari ke 22, setelah semua tikus telah mengalami fase estrus. Tikus dimatikan dengan cara dimasukkan ke dalam killing bottle, kemudian diambil darahnya melalui mata tikus vena orbitalis dengan pipa hematokrit kemudian tikus dibedah dan diambil organ uterusnya untuk dibuat preparat histologi. Preparat organ uterus, dan preparat eritrosi dan lekosit diamati menggunakan mikroskop untuk mengetahui akibat pengaruh pemberian ekstrak biji pepaya terhadap jumlah kelenjar endometrium per satuan lapang pandang pada struktur penampang melintang uterus dengan perbesaran lensa objektif 10x dilihat pada layar monitor, jumlah eritrosit dan lekosit tikus putih Rattus norvegicus betina kemudian dilakukan analisis terhadap hasil perhitungan tersebut. 52

L. Desain Penelitian

Desain pada penelitian ini merupakan eksperimen satu faktor pola acak lengkap. Jenis data dari hasil penelitian ini merupakan eksperimen.

M. Teknik Analisis Data

Data yang diperoleh merupakan data kuantitatif dari hasil pengamatan dan penghitungan jumlah kelenjar endometrium per satuan lapang pandang pada struktur penampang melintang uterus dengan perbesaran lensa objektif 10x dilihat pada layar monitor, jumlah eritrosit dan lekosit tikus putih yang telah diberi perlakuan, yaitu pemberian ekstrak biji pepaya. Analisis data menggunakan program SPSS 16 dengan analisis nonparametrik Kruskal- Wallis untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh pemeberian ekstrak biji pepaya terhadap jumlah kelenjar endometrium tikus putih tikus putih. dan Data jumlah eritrosit dan lekosit pada tikus putih dianalisis menggunakan analisis kontrol One Way Anova dengan taraf signifikan p0,05. Analisis tersebut dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh ekstrak biji pepaya terhadap jumlah eritrosit dan lekosit tikus putih betina. Apabila hasil berpengaruh yang nyata, dilanjutkan dengan uji Duncan’s Multiple Range Test DMRT untuk membandingkan antara kelompok kontrol dengan masing-masing perlakuan, bila tidak maka tidak dilanjutkan uji Duncan’s Multiple Range Test DMRT. 53

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL

Hasil penelitian tentang pengaruh pemberian ekstrak biji pepaya Carica papaya, L. terhadap jumlah kelenjar endometrium, jumlah eritrosit dan lekosit tikus putih Rattus norvegicus betina adalah sebagai berikut : 1. Hasil Uji Definitif Pengaruh Pemberian Ekstrak Biji pepaya Terhadap Jumlah Kelenjar Endometrium Tikus Putih Betina Parameter pertama yang dihitung adalah jumlah kelenjar endometrium dengan membandingan kelompok kontrol dan 3 kelompok perlakuan yaitu pada perlakuan 1 300 mgtikushari ekstrak biji pepaya, perlakuan 2 350 mgtikushari esktrak biji pepya, perlakuan 3 400 mgtikushari ekstrak biji pepaya. Data hasil jumlah kelenjar endometrium di amati di Laboratorium Mikroskopi FMIPA UNY. Data ini diambil dengan cara mengamati preparat per satuan lapang pandang pada struktur penampang melintang uterus dengan perbesaran lensa objektif 10x dilihat pada layar monitor, dan menghitung semua jumlah kelenjar endometrium di lapisan endometrium, menggunakan counter sebagai alat bantu hitung. Hasil perhitungan uji definitif dari jumlah kelenjar endometrium ini dapat dilihat pada tabel dibawah ini, yaitu: Tabel 3. Rata-Rata Jumlah Kelenjar Endometrium Uterus Tikus Putih Betina Per Satuan Lapang Pandang dengan Perbesaran Lensa Objektif 10x Dilihat pada Layar Monitor Sebelah Kanan Sesudah Pemberian Ekstrak Biji Pepaya. Ulangan K P1 P2 P3 Rata-rata 18 24,2 18,8 24,6