22
4. Setelah 24 jam, larutan disaring dengan menggunakan kertas saring untuk
memisahkan suspensi padat dengan cairannya. 5.
Cairannya ditampung di dalam labu takar 50 ml ekstrak kemudian filtrat hasil ekstraksi dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator
selanjutnya dikeringkan dengan cara pengeringan beku menggunakan alat freeze dryer.
6. Ekstrak kasar dipindahkan ke dalam botol-botol kecil dan tutup rapat,
kemudian ditimbang untuk mengetahui rendemennya. 7.
Selanjutnya ekstrak disimpan di dalam lemari pendingin untuk dilakukan uji bioaktivitasnya.
Ekstrak kasar spons ditimbang untuk mengetahui rendemen yang didapatkan dengan rumus:
Rendemen bb =
spons basah
Berat ing
ker ekstrak
Berat x 100 ………..........1
3.3.3 Uji Sitotoksik in vitro
Uji sitotoksisitas dilakukan dengan metode MTT 3-[4,5-dimetilthiazol- 2yl]-2,5-difenil tetrazolium bromida menurut Zachary 2003. Sel T47D dikultur
dalam media DMEM lengkap yang mengandung
Fetal Bovine Serum
FBS 10 dan
penisilin streptomisin
2. Masing-masing ekstrak spons selanjutnya diuji pada konsentrasi 30 ppm
sebanyak 3 ulangan. Dibuat pula 4 macam kontrol, yaitu : kontrol sel 100 L sel + 100 L media, kontrol media 200 L media, kontrol sampel 100 L ekstrak
spons + 100 L media dan kontrol DMSO 100 L sel + 100 L konsentrasi DMSO uji. Untuk memastikan kondisi sel dalam keadaan baik dan siap untuk
digunakan dalam uji, dibuat pula kontrol sel hari ke 0
day zero
. Sebanyak 100 L larutan ekstrak spons dimasukkan ke dalam sumuran mikroplat yang telah
berisi sel tumor sebanyak 10
5
sel 100 L. Kemudian mikroplat diinkubasikan selama 24 jam dalam inkubator CO
2
. Setelah diinkubasikan selama 24 jam, selanjutnya ke dalam mikroplat ditambahkan 10 L MTT ke dalam tiap sumuran
23
dan diinkubasikan kembali selama 4 jam dalam inkubator CO
2
. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan 100 L larutan sodium dodesil sulfat SDS 10,
selanjutnya mikroplat kembali diinkubasikan selama 12 jam dalam ruang gelap pada suhu kamar. Setelah inkubasi tersebut, absorbansi tiap sumuran diukur
dengan DYNEX spektrofotometer microplate reader pada panjang gelombang 570 nm.
Penentuan persentase kematian sel dihitung berdasarkan rumus: Kematian =
100 x
B -
A C
- A
…………………………..2 Keterangan: A = Absorbansi sumuran kontrol sel tanpa perlakuan ekstrak
B = Absorbansi sumuran kontrol media C = Absorbansi sumuran yang diberi ekstrak uji
3.4 Analisa Data
Dalam penelitian ini digunakan dua analisis, yaitu: 1.
Penentuan nilai
Lethal Concentration 50
LC
50
24 jam dihitung dengan menggunakan analisis probit dan persamaan regresi melalui uji probit
menurut Fisher dan Yates
in
Triyulianti 2009. Persentase kematian sel uji dikonversi menjadi angka probit berdasarkan tabel probit Lampiran 3. Plot
log konsentrasi versus angka probit masing-masing sebagai sumbu x dan sumbu y digunakan untuk mencari nilai LC
50
dari persamaan regresi yang diperoleh.
2. Analisis deskriptif digunakan untuk mendeskripsikan potensi bioaktif ekstrak
kasar terhadap sel lestari tumor T47D berdasarkan hasil LC
50
dan mendeskripsikan morfologi sel lestari tumor T47D sebelum dan sesudah
diberi perlakuan ekstrak.
