21
dalam uji ini antara lain microplate 96-well, mikropipet, inkubator CO
2
, vial, biosafety cabinet Level 2 FASTER, tabung reaksi, erlenmeyer, t-flask 25 cm
3
, mikroskop inverted OLYMPUS, dan mikroplate spektrofotometr reader DYNEX.
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Pengambilan Sampel
Tahapan pengambilan sampel: 1.
Sampel dengan berat 50 - 550 gram diambil dengan melakukan penyelaman pada kedalaman 3 – 10 m.
2. Beberapa bagian jaringan spons tersebut diambil atau dipotong dengan
menggunakan scalpel dan pinset, lalu dimasukkan kedalam plastik, kemudian dibawa ke permukaan air secara perlahan.
3. Sampel tersebut kemudian langsung dibersihkan, dipotong kecil dan
dimaserasi dengan menggunakan pelarut alkohol teknis dalam wadah plastik tahan pelarut organik dan disimpan di dalam kotak pendingin.
4. Spons didokumentasikan di habitatnya dan di atas permukaan air.
Identifikasi awal sampel dilakukan dengan membandingkan foto tiap spesies dengan pustaka yang telah ada Colin Arneson 1995.
3.3.2 Ekstraksi Spons
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi modifikasi Satari 1994,1995 in Triyulianti 2009 dengan sedikit modifikasi dengan tahapan sebagai berikut:
1. Spons yang telah disimpan dalam freezer ditimbang sebanyak 200 gram untuk
kemudian dipotong menjadi beberapa bagian kecil dan ditempatkan pada erlenmeyer 250 ml.
2. Ke dalam erlenmeyer tersebut ditambahkan larutan etanol teknis hingga
sampel terendam sepenuhnya dalam larutan lalu diaduk hingga etanol meresap ke dalam sampel.
3. Erlenmeyer ditutup dengan plastik dan simpan selama 24 jam pada suhu
kamar, lakukan kembali kegiatan tersebut hingga larutan bening.
22
4. Setelah 24 jam, larutan disaring dengan menggunakan kertas saring untuk
memisahkan suspensi padat dengan cairannya. 5.
Cairannya ditampung di dalam labu takar 50 ml ekstrak kemudian filtrat hasil ekstraksi dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator
selanjutnya dikeringkan dengan cara pengeringan beku menggunakan alat freeze dryer.
6. Ekstrak kasar dipindahkan ke dalam botol-botol kecil dan tutup rapat,
kemudian ditimbang untuk mengetahui rendemennya. 7.
Selanjutnya ekstrak disimpan di dalam lemari pendingin untuk dilakukan uji bioaktivitasnya.
Ekstrak kasar spons ditimbang untuk mengetahui rendemen yang didapatkan dengan rumus:
Rendemen bb =
spons basah
Berat ing
ker ekstrak
Berat x 100 ………..........1
3.3.3 Uji Sitotoksik in vitro
Uji sitotoksisitas dilakukan dengan metode MTT 3-[4,5-dimetilthiazol- 2yl]-2,5-difenil tetrazolium bromida menurut Zachary 2003. Sel T47D dikultur
dalam media DMEM lengkap yang mengandung
Fetal Bovine Serum
FBS 10 dan
penisilin streptomisin
2. Masing-masing ekstrak spons selanjutnya diuji pada konsentrasi 30 ppm
sebanyak 3 ulangan. Dibuat pula 4 macam kontrol, yaitu : kontrol sel 100 L sel + 100 L media, kontrol media 200 L media, kontrol sampel 100 L ekstrak
spons + 100 L media dan kontrol DMSO 100 L sel + 100 L konsentrasi DMSO uji. Untuk memastikan kondisi sel dalam keadaan baik dan siap untuk
digunakan dalam uji, dibuat pula kontrol sel hari ke 0
day zero
. Sebanyak 100 L larutan ekstrak spons dimasukkan ke dalam sumuran mikroplat yang telah
berisi sel tumor sebanyak 10
5
sel 100 L. Kemudian mikroplat diinkubasikan selama 24 jam dalam inkubator CO
2
. Setelah diinkubasikan selama 24 jam, selanjutnya ke dalam mikroplat ditambahkan 10 L MTT ke dalam tiap sumuran
