Ekstraksi dan Uji Bioaktivitas Ekstrak Kasar Spons

30 yang terlarut merupakan senyawa kimia yang memiliki kesamaan polaritas dengan pelarut. Setelah tahap maserasi dan penyaringan filtration diperoleh ekstrak kasar dari sampel spons dengan berat setelah di evaporasi serta rendemen yang diperoleh adalah seperti yang terlihat pada Tabel 2. Rendemen merupakan nilai persentase perbandingan antara berat ekstrak kering spons dengan berat basah sampel spons. Contoh perhitungan rendemen ekstrak kasar W-19-08 dan W-36-08 dapat dilihat pada Lampiran 4. Ekstrak W-19-08 yang diperoleh dari hasil evaporasi berupa ekstrak berwarna coklat muda sedangkan ekstrak W-36-08 berupa ekstrak kenyal berwarna kuning-jingga. Kedua ekstrak ini dikeringkan terlebih dahulu menggunakan freeze dryer hingga diperoleh ekstrak kering atau disebut sebagai ekstrak kasar. Tabel 2 Nilai berat sampel basah gram dan rendemen ekstrak kasar sampel spons W-19-08 dan W-36-08. W-19-08 1 1,14 W-19-08 2 0,54 W-36-08 1 5,60 W-36-08 2 3,66 50 1,68 3,36 140 9,26 6,61 Sampel Berat basah spons gram Berat ekstrak gram Berat ekstrak total gram Rendemen ekstrak Terlihat dari Tabel 2, berat ekstrak kasar spons W-19-08 adalah 1,68 gram dan ekstrak kasar spons W-36-08 adalah 9,26 gram. Berat ekstrak dari spons selanjutnya digunakan untuk menghitung nilai rendemen hasil ekstraksi dan maserasi dalam alkohol teknis. Nilai rendemen ekstrak spons W-19-08 dan W-36- 08 masing-masing diperoleh 3,36 dan 6,61. Untuk selanjutnya pada ekstrak kasar dari spons dilakukan uji sitotoksik in vitro terhadap sel lestari kanker payudara T47D yang terlebih dahulu ditumbuhkan pada medianya. Uji ini dilakukan untuk menguji potensi senyawa yang terkandung dalam ekstrak kasar dari spons dalam menghambat pertumbuhan 31 atau mematikan sel uji T47D. Uji sitotoksik ekstrak kasar dari spons dilakukan dengan menggunakan metode MTT. Prinsipnya adalah sel uji T47D yang telah diberi ekstrak spons pada konsentrasi tertentu diberi pereaksi MTT, diamati perubahan warna yang terjadi, dan dilakukan pengukuran absorbansi intensitas warna yang terbentuk sebagai representasi kehidupan sel uji T47D. Kemampuan ekstrak kasar dari spons pada konsentrasi tertentu dalam menghambat pertumbuhan atau mematikan sel uji T47D memperlihatkan bahwa senyawa tersebut memiliki sifat sebagai senyawa antikanker. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak kasar spons W-19-08 dan W-36-08 terlihat pada Gambar 6. 8 48 49 25 40 44 10 20 30 40 50 60 30 60 120 P e rs e n ta se k e m a ti a n s e l Konsentra si ekstra k ka sa r sponge ppm Sponge W-19-08 Sponge W-36-08 Gambar 6 Persentase kematian sel lestari tumor T47D setelah perlakuan dengan ekstrak kasar spons W-19-08 dan W-36-08 Keterangan: --- batas persentase kematian 50. Persentase kematian sel lestari tumor yang diberi perlakuan ekstrak kasar dihitung dengan rumus 2 berdasarkan hasil pengukuran dengan spektrofotometer dan contoh perhitungan persentase kematian dapat dilihat di Lampiran 5. Gambar 6 menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak kasar maka semakin tinggi persentase kematian sel tumor. Pada konsentrasi 30 ppm, persentase kematian sel T47D akibat perlakuan ekstrak W-19-08 lebih rendah daripada yang 32 diakibatkan perlakuan ekstrak W-36-08 namun persentase keduanya masih dibawah 50 sehingga kedua ekstrak dapat dikatakan memiliki aktivitas yang rendah. Menurut Andersen 1991 in Sismindari et al. 2002, suatu ekstrak dianggap aktif apabila mampu menyebabkan mortalitas 50 populasi sel tumor pada konsentrasi di bawah 30 ppm LC 50 30 ppm. Bahkan pada konsentrasi 120 ppm pun, persentase kematian sel uji tetap tidak melebihi 50. Persentase kematian yang rendah tersebut diduga disebabkan karena senyawa yang terkandung di dalam ekstrak kasar masih merupakan campuran senyawa kimia. Senyawa-senyawa tersebut dapat bersifat antagonis atau saling meniadakan sehingga ekstrak ini memiliki persentase kematian yang rendah. Jika dibandingkan dengan hasil uji sitotoksik pada tahun 2008, hasil uji sitotoksik diatas menunjukkan penurunan aktivitas biologis ekstrak kasar kedua spons yang diperoleh dari hasil ekstraksi sampel spons yang telah melalui masa penyimpanan. Sebenarnya kedua hasil tersebut tidak dapat dibandingkan karena beberapa dugaan berikut ini: 1. uji sitotoksik in vitro dilakukan oleh orang berbeda dan prosedur kerja yang baru sehingga kondisi pada saat uji sudah berbeda dan prosedur kerja yang baru perlu diverifikasi; 2. generasi sel uji T47D pada uji tahun 2008 berbeda dengan generasi pada saat uji tahun 2010. Generasi sel uji pada tahun 2008 merupakan hasil pembiakan yang lama dan diduga sudah resisten terhadap ekstrak uji; 3. masa penyimpanan dalam pelarut dalam waktu yang lama dapat menyebabkan senyawa yang terkandung di dalam spons mengalami perubahan struktur secara kimiawi karena dapat terjadi reaksi alkilasi atau esterifikasi Ebada et al. 2008; 4. metabolit sekunder yang terkandung dalam spons dihasilkan oleh simbionnya. Sejumlah publikasi mengungkapkan beberapa jenis mikroorganisme yang bersimbiosis dengan spons ternyata juga menghasilkan metabolit sekunder yang sama dengan metabolit sekunder yang diisolasi dari spons Lee et al. 2001; Piel 2004; Piel et al. 2004; Radjasa 2008. Oleh karena itu, dapat diduga mikroorganisme yang hidup 33 dalam spons tersebut telah mati selama masa penyimpanan namun dugaan ini perlu dikaji dan dibuktikan lebih lanjut. Perhitungan nilai Lethal Concentration LC 50 24 jam ekstrak kasar sampel spons dilakukan berdasarkan hasil persentase kematian sel T47D pada seri konsentrasi ekstrak Gambar 6 dengan menggunakan analisis probit. Tabel 3 menunjukkan nilai LC 50 ekstrak kasar spons W-19-08 dan W-36-08. Perhitungan ini dilakukan untuk memperkirakan konsentrasi ekstrak kasar yang menyebabkan kematian sel T47D sebesar 50. Contoh perhitungannya dapat dilihat pada Lampiran 5. Nilai LC 50 menunjukkan bahwa ekstrak kasar W-19-08 akan menyebabkan kematian sel T47D sebesar 50 pada konsentrasi 156,14 ppm, sedangkan ekstrak kasar W-36-08 akan menyebabkan kematian sel T47D sebesar 50 pada konsentrasi 97,04 ppm. Tabel 3 Nilai LC 50 ekstrak kasar spons W-19-08 dan W-36-08 terhadap sel T47D. No Sampel LC 50 ppm 1 W-19-08 156,14 2 W-36-08 97,04

4.3 Morfologi sel T47D hasil uji sitotoksik

Gambar 7 memperlihatkan bentuk morfologi sel normal T47D sebelum perlakuan dengan ekstrak kasar spons W-19-08 dan W-36-08 atau disebut sebagai kontrol sel. Gambar 8 dan Gambar 9 memperlihatkan bentuk morfologi sel T47D sesudah perlakuan dengan ekstrak kasar spons W-19-08 dan W-36-08. Gambar- gambar tersebut diperoleh dari hasil pemotretan di bawah mikroskop inverted dengan pembesaran 100x. Dari hasil pengamatan secara morfologi terhadap sel uji setelah 24 jam, terlihat adanya bentuk daya hambat pertumbuhan sel dengan terjadinya kerusakan sel uji T47D. Gambar 8 memperlihatkan perubahan morfologi dan jumlah sel T47D yang mendapat perlakuan ekstrak W-19-08 pada konsentrasi 30 ppm dan 60 ppm sedangkan pada konsentrasi 120 ppm perubahan morfologi sel uji tidak dapat 34 diamati karena sel uji yang tersisa tidak terlihat lagi. Perubahan morfologi sel uji akibat perlakuan dengan ekstrak W-36-08 pada konsentrasi 30 ppm dan 60 ppm Gambar 7 Sel uji T47D tanpa perlakuan ekstrak kasar sel normal T47D ditunjukkan dalam lingkaran merah. juga terlihat Gambar 9, bahkan pada konsentrasi 60 ppm hampir tidak terlihat lagi sel ujinya. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak, semakin berkurang jumlah selnya yang terlihat. Ekstrak dari sampel spons terlihat menyebabkan berkurangnya jumlah sel uji dibandingkan kontrol sel Gambar 7 dan terjadinya kerusakan pada membran plasma sel shrunk, burst, grainy dan selain itu juga pada pengamatan terlihat adanya perubahan bentuk sel round, ballooned. Secara visual, dapat dikatakan bahwa ekstrak kasar kedua spons aktif karena mematikan hampir sebagian besar sel T47D pada konsentrasi diatas 60 ppm namun hasil perhitungan persentase kematian menunjukkan persentase kematian ekstrak kasar pada konsentrasi tersebut tidak melebihi 50 Gambar 6. Hal ini disebabkan persentase kematian dihitung berdasarkan hasil pengukuran absorbansi intensitas warna biru formazan yang terbentuk saat sel T47D bereaksi dengan ekstrak dan diberi pereaksi MTT Gambar 10 dan Gambar 11. Fenomena yang terjadi memperlihatkan masih ada sel T47D yang hidup pada konsentrasi ekstrak 120 ppm dan dapat dikatakan bahwa ekstrak kasar kedua spons memiliki sifat sitostatik yang berarti ekstrak berfungsi menghambat pertumbuhan sel T47D dan tidak mematikan sel tersebut atau sitotoksik. Kontrol sel