dipasangkan sisir. Setelah membeku, gel agarosa dimasukkan ke dalam alat elektroforesis yang telah berisi larutan bufer TAE 1x. Sebanyak 5 µL larutan
DNA dicampur dengan 1 µ L 6x loading dye, dihomogenkan dengan bantuan mikropipet, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Elektroforesis
dilakukan selama 30 menit pada 100 volt. Pewarnaan dilakukan dengan cara merendam gel agarosa dalam larutan ethidium bromida 50 µLL selama 10
menit, kemudian dibilas dengan merendam gel agarosa dalam akuades selama 10 menit. Hasil elektroforesis dilihat dan sidokumentasi menggunakan alat Gel doc
Universal Hood Biorad. Konsentrasi DNA hasil isolasi diuji dengan Nanodrop 2000c Thermo
Scientific. Larutan yang digunakan sebagai blank dalam mengukur konsentrasi DNA hasil isolasi adalah larutan yang sama yang digunakan sebagai pelarut DNA,
yaitu elute solution TE dari GenElute kit. Sebanyak 1 µL TE diteteskan pada bagian pedestal bagian dari alat tempat meletakkan sampel. Konsentrasi DNA
akan muncul dalam satuan ngµL.
3.5 Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA dilakukan terhadap seluruh sampel dengan 14 pasang primer mikrosatelit Tabel 3, Lampiran 1. Amplifikasi DNA menggunakan
volume larutan 15 µL yang mengandung 1x larutan bufer PCR, 0.3 mM untuk setiap primer, 100 µM dNTP mix, 1.5 unit enzim Taq polimerase, 2.5 mM larutan
MgCl
2
, 2µ L DNA sampel 10 ngµL, dan ddH
2
O sebagai penyesuai volume. Campuran dimasukkan dalam tabung mikro PCR 0.2 mL, kemudian ditambahkan
setetes mineral oil. Amplifikasi DNA dilakukan dengan mesin PCR Thermal Cycler Veriti 96 well Applied Biosystem dengan denaturasi awal 95°C selama 1
menit, denaturasi pada 94°C selama 30 detik, penempelan primer pada 51°C selama 60 detik, perpanjangan awal pada 72°C selama 120 detik untuk 35 siklus.
Perpanjangan akhir dilakukan pada 72°C selama 8 menit.
3.6 Elektroforesis DNA Hasil Amplifikasi
Elektroforesis dilakukan menggunakan QIAxcel Sistem. Prinsip pemisahan QIAxcel dilakukan dalam kapiler cartridge gel, dimana setiap sampel otomatis
masuk di dalam kapiler. DNA yang bermuatan negatif bermigrasi melalui kapiler ke ujung bermuatan positif melewati detektor yang mendeteksi dan mengukur
sinyal serta mengubah sinyal emisi ke data elektronik yang kemudian ditampilkan sebagai gambar gel Gambar 4.
Alat QIAxcel dan komputer yang akan digunakan dihidupkan, kemudian memasukkan QX alignment marker ke dalam tray alat. Sampel hasil amplifikasi
dalam tabung mikro PCR 0.2 mL atau plate 96 well diletakkan dalam sampel tray alat. Pada tampilan “Instrumen Control” memerlukan beberapa informasi yang
perlu diisi. Proses elektroforesis akan dimulai setelah mengklik “Run”. Hasil dari
elektroforesis dengan alat QIAxcel diperoleh elektrogram dan hasil amplifikasi ditampilkan dalam gambar gel.
3.7 Analisis Data
Data penelitian yang diperoleh berupa pita-pita DNA hasil amplifikasi menggunakan primer mikrosatelit tanpa adanya ulangan. Setiap pita yang muncul
pada gel merupakan satu alel tertentu. Profil DNA merupakan data alel yang teramati dengan ketentuan adanya pita DNA berdasarkan ukuran produk PCR
pada satu lokus yang sama dari beberapa bahan tanam yang digunakan. Alel-alel tersebut diterjemahkan menjadi data biner. Setiap alel dianggap mewakili satu
karakter dan diberi nilai berdasarkan ada tidaknya suatu alel. Nilai 1 diberikan bila ada alel dan nilai 0 bila tidak ada alel.
Hasil skoring pita-pita yang muncul maupun yang tidak ditabulasikan ke dalam bentuk excel dan diubah dalam data biner untuk memudahkan proses pada
software. Dianalisis menggunakan analisis parsimony dengan Distance Method DM program Phylogenetic Analysis Using Parsimony PAUP versi 4b.10
sehingga diperoleh hasil pengelompokan dalam bentuk dendogram pohon filogenetik. Analisis menggunakan PAUP versi 4b.10 untuk menjelaskan urutan
perubahan karakter yang terjadi pada kelompok Swofford 2003.
Tabel 3 Kode primer, sekuen primer, dan suhu penempelan primer mikrosatelit yang digunakan dalam penelitian
No. Kode
Primer Posisi di
Kromosom
Sekuen Primer 5’-3’ Suhu
°C
1 mEgCIR0059
4 F
TGCAGGGGATGCTTTTATT 51
R CCCTTAATTCCTGCCTTATT
2 mEgCIR 2414
12 F
CAATCATTGGCGAGAGA 51
R CGGTCACCTTTCAGGATATG
3 mEgCIR 2144
15 F
ACAAGGCTCTTCAAGAGAT 51
R CCACTGCCAACACTAGTAC
4 mEgCIR 3639
16 F
ACGTTTTGGCAACTCTC 51
R ACTCCCCTCTTTGACAT
5 mEgCIR 2518
3 F
GATCCCATGGTAAAGACT 51
R AAGCCTCAAAAGAAGACC
6 mEgCIR 3399
13 F
AGCCAATGAAGGATAAAGG 51
R CAAGCTAAACCCCTAATC
7 mEgCIR 3555
13 F
CATCAGAGCCTTCAAACTAC 51
R AGCCTGAATTGCCTCTC
8 mEgCIR 3569
14 F
AAGGCTTGGAGTTGAGGTAT 51
R CACCATTGCATCATTATTCC
9 mEgCIR 3519
10 F
CCACTGCTTCAAATTTACTAG 51
R GCGTCCAAAACATAAATCAC
10 mEgCIR 0878
11 F
CAAAGCAACAAAGCTAGTTAGTA 51
R CAAGCAACCTCCATTTAGAT
11 mEgCIR 3808
8 F
CCGCTAACTTGGTATAC 51
R ATTTCCAGCAGCTAATC
12 mEgCIR 0521
15 F
GTGACTTTGGGCTGAAT 51
R ACAGCATCTCCAACTCTATC
13 mEgCIR 3886
9 F
TTCTAGGGTCTATCAAAGTCATAAG 51
R AGCCACCACCACCATCTACT
14 mEgCIR 3683
2 F
GTAGCTTGAACCTGAAA 51
R AGAACCACCGGACTTAC
Billotte et al. 2005; Hatorangan et al. 2010; Lampiran 1
Gambar 4 Proses pemisahan sampel menggunakan QIAxcel Sistem Qiagen 2011
Tingkat kekuatan hubungan antara perubahan alel yang terjadi pada tanaman klon yang berasal dari tahap panen embrioid pertama, kedua, dan ketiga
dianalisis menggunakan analisis korelasi Pearson. Persentase perubahan alel yang muncul pada setiap tanaman klon dibandingkan dengan semua alel yang muncul
pada tanaman ortet. Setiap pita yang muncul pada tanaman klon diasumsikan sebagai alel yang dimiliki oleh tanaman klon tersebut. Alel-alel tersebut
dibandingkan dengan alel yang muncul pada tanaman ortet kelapa sawit Tenera DxP. Alel-alel pada tanaman klon yang tidak muncul atau muncul namun tidak
dimiliki oleh tanaman ortet, diasumsikan sebagai alel yang mengalami perubahan selama proses kultur jaringan. Nilai kestabilan alel diperoleh dengan
membandingkan banyaknya alel pada tanaman klon yang sama dengan alel pada tanaman ortet kontrol dibagi seluruh alel yang muncul pada tanaman ortet.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
