3.4 Isolasi DNA
DNA genom diisolasi menggunakan metode kit GenElute Meloscia et al. 2001. Sebanyak 100 mg daun sawit digerus dengan bantuan Nitrogen cair dalam
mortar, sampai menjadi bubuk halus. Bubuk sampel dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL yang telah diisi 350 µ L larutan lisis A dan 50 µL lisis B, kemudian
divorteks. Campuran diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit, kemudian ditambahkan 130 µ L larutan PPT dan divorteks, kemudian diinkubasi pada suhu
- 20°C selama 5 menit. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 14.000 x g selama 5 menit untuk
memperoleh supernatan. Supernatan dipindahkan ke dalam kolom biru dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 x g selama 1 menit. Kolom biru dibuang,
sedangkan supernatan ditambahkan 700 µL binding solution kemudian divorteks. Kolom merah digunakan untuk mengikat DNA dalam membran. Sebanyak
500 µL column preparation solution ditambahkan ke dalam tabung merah, kemudian disentrifugasi pada 12.000 x g selama 30 menit. Selanjutnya larutan
bagian bawah dibuang. Sebanyak 700 µL campuran DNA dimasukkan ke dalam kolom merah dan disentrifugasi pada 14.000 x g selama 1 menit. Kegiatan ini
diulangi sampai campuran DNA dan binding solution habis. Pada tahap ini dihasilkan DNA yang terikat pada membran kolom merah.
Kolom merah kemudian dibilas dengan menambahkan 500 µ L wash solution dan disentrifugasi pada 14.000 x g selama 1 menit. Pembilasan diulangi
dengan menambahkan 500 µ L wash solution dan disentrifugasi pada 14.000 x g selama 3 menit. Kolom merah yang sudah dibilas dipindahkan dalam tabung
mikro 2 mL yang baru. DNA yang terikat pada membran dilarutkan dengan menambahkan 100 µL larutan TE hangat dan disentrifugasi pada 14.000 x g
selama 1 menit. Kegiatan melarutkan DNA dengan TE dilakukan sebanyak 2 kali, sehingga volume akhir larutan DNA yang di peroleh sebanyak 200 µL.
Kualitas DNA hasil isolasi diuji dengan elektroforesis gel agarosa 0.8 dalam larutan bufer TAE 1x. Gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,32 g
agarosa serbuk di dalam 40 mL TAE 1x. Selanjutnya campuran dipanaskan agar agarosa larut sempurna. Larutan agarosa dituang ke dalam cetakan yang telah
dipasangkan sisir. Setelah membeku, gel agarosa dimasukkan ke dalam alat elektroforesis yang telah berisi larutan bufer TAE 1x. Sebanyak 5 µL larutan
DNA dicampur dengan 1 µ L 6x loading dye, dihomogenkan dengan bantuan mikropipet, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Elektroforesis
dilakukan selama 30 menit pada 100 volt. Pewarnaan dilakukan dengan cara merendam gel agarosa dalam larutan ethidium bromida 50 µLL selama 10
menit, kemudian dibilas dengan merendam gel agarosa dalam akuades selama 10 menit. Hasil elektroforesis dilihat dan sidokumentasi menggunakan alat Gel doc
Universal Hood Biorad. Konsentrasi DNA hasil isolasi diuji dengan Nanodrop 2000c Thermo
Scientific. Larutan yang digunakan sebagai blank dalam mengukur konsentrasi DNA hasil isolasi adalah larutan yang sama yang digunakan sebagai pelarut DNA,
yaitu elute solution TE dari GenElute kit. Sebanyak 1 µL TE diteteskan pada bagian pedestal bagian dari alat tempat meletakkan sampel. Konsentrasi DNA
akan muncul dalam satuan ngµL.
3.5 Amplifikasi DNA
Kategori