Tempat dan Waktu Penelitian

22 setiap siklus suhu. Primer yang digunakan adalah : Universal reverse primer UniB1 5-GGTTACGCTTGTTACGACTT-3 dan Eubacterial forward primer BacF1 5-AGAGTTTGATCACTGGCTCAG-3. Sebagai substrat adalah dNTP larutan stok 20 mM, larutan kerja 10 mM. Enzim yang digunakan adalah Taq DNA polimerase. Master mix dibuat dengan melebihkan 1 reaksi dari jumlah sampel yang akan di PCR. Pembuatan master mix dilakukan dengan mencampurkan buffer PCR 10x, BacF1 5 µM, UniB1 5 µM, dNTP 10mM, ddH 2 O dan Taq DNA polimerase 50 µL. Campuran dikocok dan master mix dibagi ke dalam tabung PCR masing-masing 40 µL, selanjutnya ditambahkan 1-10 µL DNA cetakan dan ditambahkan ddH 2 O hingga volume menjadi 50 µL. Tabung diputar agar semua larutan turun dan ditempatkan dalam mesin PCR. Denaturasi awal 94 o C selama 2 menit, denaturasi pada siklus amplifikasi 94 o C selama 1 menit, anealing 48 o C selama 1 menit, elongasi 72 o C selama 1 menit dan elongasi lanjutan 72 o C selama 10 menit. Segmen yang telah diamplifikasi selanjutnya diamati dengan elektroforesis gel agarose. Larutan yang harus disiapkan adalah larutan stok TBE 10x steril, ddH 2 O steril, EtBr Etidium Bromida, loading buffer dan agarose. Pertama-tama 0.4 g agarose ditimbang dan dilarutkan dalam 40 mL TBE 1x untuk mendapatkan gel agarose 1. Larutan agarose dipanaskan hingga mendidih dan dibiarkan hingga suhu sekitar 60 o C, selanjutnya ditambahkan 3 µL larutan EtBr. Larutan agarose dituangkan ke dalam rak elektroforesis yang telah disiapkan dan dibiarkan hingga dingin. Setelah dingin, penutup rak dan sisirnya dibuka dan ditempatkan pada chamber elektroforesis yang sudah berisi buffer TBE 1x. Larutan hasil PCR dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis, begitu pula dengan marker sebagai penanda jarak. Elektroforesis dilakukan pada voltase 85 V selama 45 menit dan hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV. Pemurnian DNA hasil PCR dari gel dilakukan menggunakan GFX Purification Kit. Tabung 1.5 mL yang kosong ditimbang. Agarose yang mengandung fragmen DNA dipotong di bawah sinar UV menggunakan pisau steril dan dimasukkan ke dalam tabung yang sudah ditimbang. Selanjutnya tabung berisi gel ditimbang dan selisihnya dihitung. 10 µL buffer ditambahkan ke dalam setiap 10 mg bobot gel. Tabung ditutup dan diputar hingga isinya tercampur, diinkubasi pada 60 o C hingga semua agarose larut 5-15 menit. Selama inkubasi, satu kolom GFX ditempatkan pada tabung penampung. Setelah agarose larut semuanya, diputar sebentar untuk mengumpulkan larutan pada dasar tabung. Sampel dipindahkan ke kolom GFX dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruang, selanjutnya diendapkan pada kecepatan maksimal selama 30 detik. Larutan pada tabung penampung dibuang dan kolom GFX ditempatkan kembali ke dalam tabung penampung. Ke dalam kolom ditambahkan 500 µL buffer dan diendapkan selama 30 detik pada kecepatan maksimal. Larutan pada tabung dibuang dan kolom GFX dipindahkan ke dalam tabung baru berukuran 1.5 mL. DNA dielusi dengan 50 µL ddH 2 O atau buffer elusi, diinkubasi pada 37 o C selama 3 menit, kemudian diendapkan pada kecepatan maksimum selama 1 menit. Konsentrasi hasil GFX diperiksa dengan elektroforesis gel agarose. Konsentrasi DNA hasil GFX dihitung