Produksi Gula dan Kaitannya dengan Fotosintesis
18
yang digunakan adalah campuran tanah ultisol dan pasir dengan perbandingan 1:1 vv. Media tanam selanjutnya disterilisasi dengan cara mencampurkannya dengan
bahan kimia Basamid-G 10 g per 100 kg media tanam dan diinkubasi selama seminggu sebelum digunakan. Benih sorgum manis sebelum ditanam disterilisasi
terlebih dahulu dengan cara direndam dalam HClO
4
2 selama sepuluh detik, kemudian dibilas dengan akuades sebanyak tiga kali.
Untuk seleksi FMA, rancangan penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap satu faktor, yaitu jenis FMA A yang terdiri dari :
A0 = Tanpa inokulasi FMA kontrol A1 = FMA jenis 1
A2 = FMA jenis 2 Sampai dengan
A40 = FMA jenis 40 Setiap perlakuan diulang 2 kali sehingga diperoleh 41 x 2 = 82 satuan
penelitian Untuk seleksi rizobakteri, rancangan penelitian menggunakan Rancangan
Acak Lengkap satu faktor, yaitu jenis rizobakteri B yang terdiri dari : B0 = Tanpa inokulasi bakteri kontrol
B1 = Rizobakteri jenis 1 B2 = Rizobakteri jenis 2
sampai dengan B134 = Rizobakteri jenis 134
Setiap perlakuan diulang 2 kali sehingga diperoleh 135 x 2 = 270 satuan penelitian. Pemeliharaan tanaman meliputi penyiraman yang dilakukan 2 kali dalam
sehari, pagi dan sore. Setiap 2 minggu sekali diukur peubah tinggi tanaman dan kandungan klorofil daun sorgum manis selama masa percobaan 2 bulan. Setelah 2
bulan derajat kolonisasi mikoriza pada perakaran tanaman diamati di bawah mikroskop.
Penetapan Kemampuan Penambatan N
2
Isolat-isolat rizobakteri yang dapat meningkatkan pertumbuhan dan kandungan klorofil sorgum manis selanjutnya diuji kemampuannya dalam
menambat N
2
. Kemampuan penambatan N
2
ditentukan dengan mengukur aktivitas nitrogenase. Aktivitas nitrogenase secara tidak langsung diukur berdasarkan
pengukuran pengurangan gas asetilen menjadi gas etilen atau ARA Acetylene Reduction Assay Bergensen 1980. Pengukuran ARA cukup bisa mewakili
aktivitas nitrogenase dibandingkan metode lain secara tidak langsung.
Sebelum dilakukan pengukuran konsentrasi gas etilen dalam sample, terlebih dahulu harus dibuat kurva standar dari gas etilen yang diketahui kadarnya. Kurva
standar terdiri dari beberapa konsentrasi gas etilen. Standar gas yang digunakan biasanya lebih dari 4 tingkat konsentrasi agar ketepatannya dapat
dipertanggungjawabkan. Untuk itu diperlukan pembuatan deret standar.
Cara pembuatan standar adalah sebagai berikut : tabung yang digunakan harus kedap udara. Botol diisi dengan udara sebanyak volume botol sebagai gas
19 penyeimbang. Standar dibuat dalam berbagai konsentrasi. Sebelum gas standar
dimasukkan, botol dikosongkan terlebih dahulu sebanyak gas yang akan dimasukkan ke dalam botol.
Pengukuran produksi etilen pada sampel diukur dengan prosedur yang sama dengan pengukuran pada standar. Konsentrasi etilen dalam sampel diperoleh
dengan cara ekstrapolasi terhadap kurva standar.
Penetapan Kemampuan Pelarutan Fosfat
Penetapan kemampuan pelarutan fosfat dilakukan dengan menggunakan teknik spektrofotometri Dick dan Tabatabai 1977. Pembuatan reagen dilakukan
dengan cara melarutkan 0.704 g asam askorbat dan 3.268 g asam trikloroasetat dalam 10 mL air dan menambahkan lagi air hingga volume 40 mL reagen A,
melarutkan 2.472 g amonium molibdat dalam 100 mL air dan menambahkan lagi air hingga volume 200 mL reagen B, serta melarutkan 5.882 g natrium sitrat dalam
10 mL asam asetat glasial dan mengatur volume hingga 200 mL reagen C.
Untuk menentukan fosfat terlarut dicampurkan 0.32 mL sampel dan bufferair, 0.40 mL reagen A, 0.08 mL reagen B, dan 0.20 mL reagen C. Absorbansi
diukur pada panjang gelombang 850 nm setelah 30 menit inkubasi. Sebagai standar digunakan protein kombinasi dari asam-asam fosfat sigma.
Penetapan Kemampuan Produksi Fitohormon
Untuk mengukur kemampuan produksi fitohormon IAA, tiap bakteri ditumbuhkan pada media pertumbuhan minimal 5 g glukosa, 0.025 g yeast extract,
0.204 g L-tryptophan sebanyak 5 mL dalam tabung selama 72 jam pada suhu 20 °C dengan agitasi 120 rpm. Selanjutnya 1 mL suspensi bakteri dipindahkan ke
dalam 1.5 mL tabung dan diendapkan pada 16.750 xg selama 10 menit. Sebanyak 90 µL supernatan ditambahkan ke dalam 60 µL reagen Salkowski 0.5 M FeCl3
dan 35 asam perklorat = 1:49 dan diinkubasi selama 30 menit dalam keadaan gelap. Absorbansi dari tiap sampel selanjutnya diukur dengan Spektrofotometer
pada panjang gelombang 530 nm Furnkranz et al. 2009. Sebagai standar digunakan IAA sintetik yang telah diketahui konsentrasinya.
Untuk mengukur kemampuan produksi fitohormon GA, tiap bakteri ditumbuhkan di dalam media Jensen’s Broth selama 5 hari pada temperatur 28
o
C. Selanjutnya kultur bakteri diendapkan untuk memisahkan biomassanya. Filtrat
yang dihasilkan dimasukkan ke dalam corong pisah ukuran 100 mL. Air ditambahkan hingga volume 10 mL. Keasaman atau pH larutan diatur antara 1 dan
2 dengan menggunakan HCl 0.1 M. Etil asetat sebanyak 20 mL ditambahkan dan dikocok selama 60 detik. Fasa air selanjutnya dipindahkan ke dalam corong pisah
kedua dan prosedur ekstraksi diulang dengan penambahan etil asetat sebanyak 20 mL. Fasa air dipisahkan kembali dan fasa organik ditampung di corong pisah yang
pertama. GA diekstraksi kembali dari etil asetat dengan menambahkan 20, 15 dan 10 mL buffer fosfat pH 7.4, selanjutnya dikocok selama 60 detik dan setiap
ekstrak dikumpulkan dalam labu ukur 50 mL. Volume labu dipenuhi dengan menambahkan buffer fosfat Berrí’os et al. 2004.