Jenis dan Rancangan Penelitian Bahan Penelitian Skema Alur Penelitian

27

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental murni dengan rancangan sederhana acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel utama

a. Variabel bebas. Variabel bebas penelitian ini adalah peringkat dosis dalam pemberian infusa biji Persea americana Mill. gKg BB. b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dari penelitian ini adalah perubahan kadar SGPT dan kadar SGOT darah setelah pemberian infusa biji alpukat Persea americana Millm.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dari penelitian ini adalah kondisi hewan uji, yaitu berupa tikus galur Sprague Dawley, jenis kelamin jantan dan betina, umur 2-3 bulan, berat badan 150-250 g yang diperoleh dari Laboratorium Hayati Imono, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Frekuensi pemberian infusa Persea americana Mill. satu kali sehari dua puluh delapan hari berturut-turut dengan waktu pemberian yang sama secara per oral. Selain itu, variabel pengacau juga dari bahan uji yang digunakan berupa biji alpukat yang mempunyai waktu panen, tempat tumbuh dan suhu yang sama. b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dari penelitian ini adalah kondisi patologis dari tikus jantan dan betina galur Sprague Dawley yang digunakan dalam penelitian.

3. Definisi operasional

a. Infusa biji alpukat. Infusa yang dianalisis merupakan ekstraksi simplisia biji alpukat Persea americana Mill. sebanyak 8 g pada suhu 90 g dengan menggunakan pelarut aquadest sebanyak 100 mL selama 15 menit, sehingga menghasilkan infusa biji alpukat dengan konsentrasi 8 bv. b. Biji Persea americana Mill. Biji Persea americana Mill. yang digunakan adalah biji alpukat segar yang tidak busuk. c. Dosis infusa biji alpukat. Dosis yang diberikan kepada tikus kelompok perlakuan, yaitu sebesar dosis I= 202,24 mgkgBB, dosis II= 360 mgkgBB, dosis III= 640,8 mgkgBB dan dosis IV= 1140,6 mgkgBB. d. Perubahan kadar SGPT dan SGOT darah. Perubahan kadar SGPT dan SGOT darah ditunjukkan dengan adanya peningkatan atau penurunan yang berbeda bermakna pada kelompok perlakuan yang diberi infusa biji alpukat yang dibandingkan dengan kelompok kontrol aquadest pelarut setelah pemberian infusa biji alpukat post perlakuan selama 28 hari. e. Pemberian subakut. Pemberian infusa biji alpukat Persea americana Mill. satu kali sehari selama 28 hari berturut-turut pada waktu yang sama secara per oral.

C. Bahan Penelitian

Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah 25 tikus jantan dan 25 tikus betina galur Sprague Dawley, yang berumur 2-3 bulan dengan berat badan 150-250 g yang diperoleh dari Laboratorium Hayati Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Biji Persea americana Mill. yang digunakan diperoleh dari Depot Es Teller 77 yang berada di Galleria Mall Yogyakarta yang diambil dari perkebunan alpukat di Klaten pada bulan Juni 2014. Biji buah alpukat yang digunakan berasal dari buah alpukat yang belum atau tidak mengalami pembusukan. Selain itu, juga digunakan aquadest untuk pelarut dalam pembuatan infusa biji alpukat yang diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Asupan makanan tikus dengan menggunakan pellet AD2 dan bahan minuman untuk hewan uji, yaitu air reverse osmose RO yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penelitian dengan menggunakan hewan coba ini telah mendapatkan Ethical Clearence dari Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta lampiran 8.

D. Alat dan Instrumen Penelitian 1. Alat pembuatan simplisia

Alat-alat yang digunakan untuk pembuatan simplisia meliputi timbangan digital, oven, blender, ayakan no. 40, wadah untuk menyimpan serbuk biji alpukat.

2. Alat penetapan kadar air

Alat-alat yang digunakan untuk penetapan kadar air meliputi timbangan, sendok, moisture balance, dan stopwatchm

3. Alat pembuatan infusa biji alpukat

Alat-alat yang digunakan untuk pembuatan infusa biji alpukat meliputi panci enamel, timbangan analitik, Bekker glass, batang pengaduk, gelas ukur, thermometer, stopwatch, cawan porselen, penangas air, kain flannel dan waterbath, kompor listrik. 4. Alat uji toksisitas biji alpukat Alat-alat yang digunakan untuk pengujian toksisitas inusa biji alpukat meliputi timbangan, Bekker glass, jarum suntik per oral, spuit injeksi, eppendorf, pipa kapiler haematokrit, kandang tikus metabolic cage.

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi biji alpukat

Determinasi biji alpukat Persea americana Mill. dilakukan dengan mencocokkan ciri-ciri makroskopis dan mikroskopis biji Persea americana Mill. yang diperoleh dari Depot Es Teller 77 yang berada di Galleria Mall Yogyakarta dengan biji yang telah diketahui pasti merupakan biji Persea americana Mill. berdasarkan ciri-ciri morfologinya. Determinasi dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

2. Pengumpulan biji alpukat

Pada penelitian ini bahan uji yang digunakan adalah biji alpukat. Biji alpukat diperoleh dari Depot Es Teller 77 yang berada di Galleria Mall Yogyakarta pada bulan Juni 2014. Biji buah alpukat yang digunakan berasal dari buah alpukat yang belum atau tidak mengalami pembusukan.

3. Pembuatan serbuk biji alpukat

Biji alpukat yang telah diperoleh dibersihkan dari kulit luarnya, dicuci dengan air mengalir, dipotong tipis kemudian dikeringkan dengan dimasukkan kedalam oven yang sudah diatur suhunya, suhu yang digunakan 50 g selama 72 jam. Potongan biji yang telah kering kemudian diserbuk dan diayak dengan menggunakan ayakan no. 40.

4. Penetapan kadar air serbuk biji alpukat

Penetapan kadar air menggunakan metode gravimetri dengan bantuan alat Moisture Balance. Penetapan kadar air dilakukan dengan cara serbuk kering biji Persea americana Mill. yang sudah diayak sebanyak ±5,0 g dimasukkan kedalam alat Moisture Balance, kemudian diratakan. Bobot serbuk kering biji tersebut dilakukan pemanasan dengan suhu 105 g selama 15 menit, kemudian secara otomatis persen kadar air akan muncul pada alat moisture balanced.

5. Pembuatan infusa biji alpukat

Serbuk kering ditimbang 8,0 g, kemudian serbuk kering tersebut dimasukkan dalam panci enamel lalu dibasahi dengan aquadest sebanyak dua kali bobot bahan yang ditimbang, yaitu 16 ml aquadest. Sebanyak 100,0 mL pelarut aquadest dimasukkan kedalam panci enamel yang berisi serbuk yang telah dibasahi kemudian dipanaskan diatas penangas air pada suhu 90 g selama 15 menit. gampuran kemudian diambil dan ditambah aquadest panas hingga didapatkan volume perasan 100 mL infusa biji Pm americana Mill.

0. Penetapan dosis infusa biji alpukat

Peringkat dosis infusa biji alpukat didasarkan pada pengobatan yang biasa digunakan oleh masyarakat, yaitu ± 2 sendok makan 4 g serbuk yang direbus dengan 250 mL air. Maka dosis perlakuan yang digunakan adalah 4 g 70 kg BB manusia. Berdasarkan data diatas maka konversi dosis manusia 70 kg ke tikus 200 g = 0,018 Laurence and Bacharach, 1964. Dosis untuk tikus 200 g = 0,018 x 4 g = 0,72 g 200 gBB = 360 mgkgBB Berdasarkan hasil orientasi infusa penelitian yang dilakukan oleh Yoseph 2013, konsentrasi maksimal infusa biji alpukat yang dapat dibuat adalah 8g100ml dengan asumsi berat badan hewan uji maksimal adalah 350 g dan volume maksimal pemberian infusa secara p.o = 5 ml. Maka dilakukan perhitungan untuk menentukan dosis tinggi perlakuan dengan rumus : D x BB = g X V D x 350 g = 8 g 100ml x 5 ml D = 1142,8 mgkgBB Kemudian dihitung faktor kelipatan dari dosis rendah dan dosis tinggi. Untuk menentukan peringkat dosis infusa biji Persea americana Mill. dilakukan perhitungan sebagai berikut: = , = 1,78 Faktor Kelipatan Berdasarkan faktor kelipatan yang maka diperoleh 4 peringkat dosis, yaitu: Dosis I : 360 mgkgBB : 1,78 = 202,24 mgkgBB Dosis II : 360 mgkgBB Dosis III : 360 mgkgBB x 1,78 = 640,8 mgkgBB Dosis IV : 640,8 mgkgBB x 1,78 = 1140,6 mgkgBB

7. Penetapan dosis aquadest sebagai kontrol negatif

Untuk menentukan dosis aquadest digunakan berat badan tertinggi untuk mengetahui jumlah volume maksimum yang harus diberikan kepada hewan uji. Berdasarkan rumus didapatkan volume maksimum, yaitu : Konsentrasi aquadest: 1 gmL = 1000 mgmL D x BB = g x V D x 350 g = 1000 mg mL x 5 mL D = D = 14285,7 mg kgBB Maka dosis aquadest yang digunakan, yaitu sebesar 14285,7 mg kgBB.

8. Penyiapan hewan uji

Hewan uji yang digunakan terdiri dari tikus putih jantan dan betina, galur Sprague Dawley, umur 2-3 bulan, berat badan 150-250 g, berjumlah 50 ekor 25 jantan dan 25 betina disiapkan dan ditempatkan dalam metabolic cage, satu kandang untuk satu tikus. Tiga hari sebelum perlakuan hewan uji diadaptasikan pada metabolic cage. Penelitian dengan hewan coba ini telah mendapatkan Ethical Clearence dari Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada lampiran 8.

9. Pengelompokan hewan uji

Pada penelitian ini digunakan lima kelompok perlakuan sebanyak lima puluh ekor tikus, dibagi menjadi lima kelompok secara acak, yaitu satu kelompok kontrol dan empat kelompok perlakuan, masing-masing kelompok uji terdiri dari sepuluh ekor tikus lima tikus jantan dan lima tikus betina. Kelompok I : diberi sediaan infusa biji alpukat dengan dosis 202,24 mgkgBB Kelompok II : diberi sediaan infusa biji alpukat dengan dosis 360 mgkgBB Kelompok III : diberi sediaan infusa biji alpukat dengan dosis 640,8 mgkgBB Kelompok IV : diberi sediaan infusa biji alpukat dengan dosis 1140,6 mgkgBB. Kelompok V : kelompok kontrol negatif diberi aquadest dengan dosis sebesar 14285,7 mg kgBB.

10. Prosedur pelaksanaan toksisitas subakut

Sediaan uji berupa infusa biji alpukat yang diberikan kepada hewan uji sesuai dosis pemberian dengan kekerapan pemberian satu kali sehari selama 28 hari pada tikus dengan tetap diberikan makan dan minum. Pada hari pertama masa uji sebelum dilakukan perlakuan dan pada hari ke-29, semua tikus diambil darahnya melalui sinus orbital mata, ditampung pada eppendorf berisi heparin untuk diambil serum darah kemudian dilakukan pengukuran kadar SGPT dan SGOT darah tikus. Pengukuran kadar SGPT dan SGOT dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Pada penelitian ini dilakukan pengukuran kadar SGPT dan SGOT dua kali, yaitu pada pre perlakuan dan post perlakuan dengan tujuan supaya dapat mengetahui adanya peningkatan ataupun penurunan dari kadar tersebut.

11. Pengamatan

a. Pengamatan berat badan hewan uji. Pada pengamatan berat badan hewan uji maka dilakukan dengan cara menimbang hewan uji dengan menggunakan timbangan. Penimbangan berat badan hewan uji ini dilakukan setiap hari selama 28 hari. Perhitungan purata berat badan tikus dilakukan dengan cara menambahkan berat badan tikus kemudian dibagi dengan jumlah tikus ditiap kelompok yang dilakukan pada hari 0, 7, 14, 21, 28. b. Pengukuran asupan pakan hewan uji. Hewan uji diberikan asupan pakan sebanyak 30 g setiap harinya. Untuk mengetahui seberapa besar asupan pakan yang dikonsumsi oleh tikus maka dilakukan pengukuran setiap harinya. gara mengukur besarnya asupan pakan yang diterima oleh tikus dengan menimbang pakan yang diberikan pada hari pertama, kemudian pada hari kedua dilakukan penimbangan lagi pakan yang masih tertinggal pada wadah. Selisih dari penimbangan antara berat pakan hari pertama dengan berat pakan hari kedua dihitung sebagai asupan makanan yang dihabiskan pada hari pertama, begitu seterusnya untuk hari selanjutnya. c. Pengukuran asupan minum hewan uji. Hewan uji diberikan minum berupa aquadest sebanyak 100 ml yang ditempatkan pada botol kaca bening yang diberi pipa supaya memudahkan tikus untuk minum. Pengukuran asupan minum dilakukan dengan cara memasukkan 100 ml air pada wadah di hari pertama, kemudian pada hari kedua jumlah sisa air yang masih terdapat di dalam botol dihitung kembali. Jumlah air yang diminum oleh tikus pada hari pertama dihitung dengan cara mengurangkan jumlah air minum yang diberikan pada hari pertama dengan jumlah air minum sisa pada hari kedua, begitu seterusnya untuk pengukuran dihari berikutnya.

F. Tata Cara Analisis Hasil Penelitian 1. Pemeriksaan kadar SGPT dan SGOT darah

Penetapan kadar SGPT dilakukan dengan metode optimized UV test. L- alanin pereaksi A dan 2-oksoglutarat pereaksi B dengan adanya SGPT akan menjadi L-glutamat dan piruvat, hasil urai tersebut dengan adanya NADH dan laktat dehydrogenase LD akan direduksi menghasilkan L-laktat dan NAD + . Jumlah hasil urai yang terbentuk diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm pada suhu 37 g tepat pada menit ke-1 sebagai A1, menit ke-2 sebagai A2 dan menit ke-3 sebagai A3. Kadar SGPT dapat ditentukan dengan menghitung rata-rata selisih absorbansi setiap menit dikali faktor 1745. Penetapan kadar SGOT dilakukan dengan metode optimized UV test. L- aspartat pereaksi A dan 2-oksoglutarat pereaksi B dengan adanya SGOT akan menjadi L-glutamat dan oksaloasetat, hasil urai tersebut dengan adanya NADH akan direduksi menghasilkan L-malat dan NAD + . Jumlah hasil urai yang terbentuk diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm pada suhu 37 g tepat pada menit ke-1 sebagai A1, menit ke- 2 sebagai A2 dan menit ke-3 sebagai A3. Kadar SGOT dapat ditentukan dengan menghitung rata-rata selisih absorbansi setiap menit dikali faktor1745. Data kadar SGPT dan SGOT darah tikus dianalisis dengan uji Kolmogorov Smirnov untuk melihat distribusi data tiap kelompok. Apabila distribusi data normal maka analisis dilanjutkan dengan analisis pola searah One- Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan masing-masing kelompok, jika terdapat perbedaan yang bermakna p0,05 maka dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk mengetahui perbedaan antar kelompok. Apabila hasil analisis dengan uji Kolmogorov Smirnov data menunjukkan distribusi yang tidak normal maka analisis dilanjutkan dengan analisis non parametik, yaitu Kruskal Walis untuk melihat perbedaan kadar SGPT dan SGOT darah antar kelompok, dilanjutkan dengan uji Mann Whitney untuk mengetahui perbedaan uji tiap kelompok. Untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan bermakna sebelum dan sesudah perlakuan dilakukan uji paired-T test untuk semua kelompok perlakuan.

2. Pengamatan berat badan hewan uji

Data perubahan berat badan merupakan data pendukung dengan dihitung purata kenaikan berat badan pada hari ke 0,7, 14, 21, dan pada hari 28. Data perubahan berat badan dianalisis dengan menggunakan General Linier Model Multivariate. Dari hasil General Linier Model Multivariate akan terbaca nilai sig berat badan sehingga akan tampak adanya perbedaan yang signifikan atau tidak.

3. Pengukuran asupan pakan hewan uji

Data pengukuran asupan pakan hewan uji dilakukan dengan menghitung purata harian asupan pakan hewan uji. Setelah 28 hari, profil pola makan dibuat dengan menggunakan grafik.

4. Pengukuran asupan minum hewan uji

Data pengukuran asupan minum hewan uji dilakukan dengan menghitung purata harian asupan minum hewan uji. Setelah 28 hari, profil pola minum dibuat dengan menggunakan grafik.

G. Skema Alur Penelitian

Hewan uji ditempatkan dalam metabolic cage secara acak dan diadaptasikan selama 3 hari sebelum memulai perlakuan Sebelum hari I, hewan uji ditimbang dan tidak diberi asupan pakan selama 5 jam sebelum pengambilan darah Dilakukan pengambilan darah pre perlakuan Hewan uji ditimbang sebelum dilakukan pengambilan darah Hewan uji dikembalikan dalam metabolic cage Empat jam setelah pengambilan darah hewan uji diberi infusa biji alpukat secara peroral dan diberi asupan pakan selama 28 hari pada jam yang sama, Kel I. 202,24 mgkgBB Kel II. 360 mgkgBB Kel III. 640,8 mgkgBB Kel IV. 1140,6 mgkgBB Kel kontrol 14285,7 mgkgBB Dilakukan pengukuran asupan pakan, minum dan pengamatan berat badan selama 28 hari Selama 28 hari pemberian infusa biji alpukat secara peroral pada hewan uji Setelah diberikan infusa biji alpukat selama 28 hari, pada hari ke-29 hewan uji dipuasakan kembali seperti yang dilakukan diawal sebelum pengambilan darah Dilakukan pengambilan darah post perlakuan 50 ekor tikus yakni 25 jantan dan 25 betina masing-masing dibagi kedalam 5 kelompok 40

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah secara umum ingin mengetahui ada tidaknya potensi efek toksik subakut dari biji alpukat Persea americana Mill. pada organ hati terhadap perubahan biokimia yang dilihat dari adanya perubahan kadar SGPT dan SGOT darah. Penelitian ini juga bertujuan untuk mengetahui hubungan kekerabatan antara dosis pemberian infusa biji alpukat Persea americana Mill. dengan efek toksik secara subakut pada hati terhadap perubahan biokimia hati yang dilihat dari perubahan kadar SGPT dan SGOT darah. Data pendukung pada penelitian ini adalah data berat badan, data asupan pakan dan data asupan minum. Data berat badan di analisa dengan menggunakan General Linier Model Multivariate, sedangkan data asupan pakan dan asupan minum dibuat grafik untuk melihat apakah pemberian infusa biji alpukat mempengaruhi pola makan dan pola minum hewan uji.

A. Determinasi Biji Persea americana Mill.

Pada penelitian uji toksisitas infusa biji Persea americana Mill. pada awalnya perlu dilakukan determinasi biji alpukat yang digunakan. Tujuan dilakukan determinasi ini adalah untuk memastikan bahwa biji yang digunakan pada penelitian ini benar-benar biji Persea americana Mill. dikarenakan biji alpukat mempunyai berbagai jenis varietas. Determinasi biji ini dilakukan dengan cara mengidentifikasi biji Persea americana Mill. yang digunakan sebagai