Metode Rancangan Kerangka operasional Instrumen penelitian

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan waktu penelitian 3.1.1. Tempat penelitian Penelitian ini dilakukan di Sentra Diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara serta kerjasama dengan laboratorium patologi anatomi swasta di Medan.

3.1.2. Waktu penelitian

Penelitian dilakukan selama bulan Juni 2008 sampai Maret 2009 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan sampel, penelitian dan penulisan.

3.2. Metode Rancangan

Rancangan penelitian ini menggunakan rancangan deskriptif dengan pendekatan cross sectional . 58,59 Pada penelitian ini tidak memberikan perlakuan terhadap variabel tetapi hanya melihat hasil pulasan atau ekspresi imunositokimia HER2neu. Pengukuran pada variabel hanya dilakukan satu kali dan pada satu saat. Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008

3.3. Kerangka operasional

Kerangka operasional penelitian yang akan digunakan adalah sebagai berikut : Massa pada payudara Aspirasi biopsi jarum halus Karsinoma mamma C5 Imunositokima HER2neu Penilaian hasil pulasan skor + 1 + 2 + 3 Aspirasi biopsi jarum halus ulang Gambar 3.1. Kerangka operasional penelitian 3.4. Populasi, sampel dan besar sampel penelitian 3.4.1. Populasi Populasi dalam penelitian ini adalah sediaan hapus dari sitologi yang berasal dari payudara dan didiagnosa sebagai karsinoma mamma C5 pada semua laboratorium patologi anatomi yang ada di kota Medan.

3.4.2. Sampel

Sampel dari penelitian ini adalah sediaan hapus dari sitologi yang berasal dari payudara yang memenuhi kriteria inklusi dan sesuai dengan besar sampel penelitian. Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008

3.4.3. Besar sampel penelitian

Perkiraan besarnya sampel penelitian berdasarkan perhitungan dengan menggunakan rumus : N = Z 2 .P.1-P d 2 Keterangan : • N = jumlah populasi • Z = tingkat kepercayaan 95 å 1,96 • P = proporsi hasil ekspresi pada lesi, 20 – 35 • d = ketepatan 0,2 Hasil perhitungan : N = 1,96 x 0,250.75 0,2 2 = 18,1 å 20 jumlah sampel minimal 3.5. Kriteria inklusi dan eksklusi 3.5.1. Kriteria inklusi • Pasien wanita usia tanpa batasan usia. • Mempunyai benjolan pada payudara yang secara pemeriksaaan sediaan hapus sitologi dengan pewarnaan Diff-Quik didiagnosa sebagai karsinoma mamma C5. Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008 • Mempunyai riwayat keluarga dengan atau tanpa pernah mempunyai tumor payudara atau tumor ovarium.

3.5.2. Kriteria eksklusi

Yang termasuk kriteria eksklusi adalah : • Sediaan hapus sitologi dari payudara dengan pewarnaan Diff-Quik dan didiagnosa bukan sebagai sebagai karsinoma mamma C5 • Sediaan sitologi dari payudara yang rusak dan tidak dapat diproses dengan pulasan imunohistokimia HER2neu 3.6. Variabel penelitian dan definisi operasional 3.6.1. Variabel penelitian Variabel yang diteliti adalah : • Variabel bebas adalah HER2neu • Variabel terikat adalah lesi pada payudara

3.6.2. Definisi operasional

• HER2neu merupakan gen yang normal dan berfungsi untuk mengatur pertumbuhan Gen HER2neu bertanggung jawab untuk membuat protein HER2 yang bekerja mengatur proses pertumbuhan dan pembelahan sel, terutama sel epitelial. Overekspresi akibat amplifikasi gen ini menyebabkan peningkatan transkripsi pada mRNA dan translasi protein. HER2neu 50 mempunyai struktur homolog dengan EGFR dan Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008 terdapat pada permukaan membran, transmembran dan sitoplasma 55 dan merupakan glikoprotein transmembran yang berperan sebagai kontrol pada pembelahan sel. • Hasil pewarnaan imunositokimia pada HER2neu adalah tampilan warna coklat pada membran sitoplasma sel epitel yang dinyatakan dengan : Negatif, bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana pada saat proses yang sama kontrol positif menampilkan warna yang sama dengan pewarnaan kromogen DAB. Positif, bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada membran sitoplasma sel dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x dan pada saat yang sama kontrol positif juga menampilkan warna yang sama. Tampilan pulasan dapat memberikan intensitas lemah, jika ≤ 10 sel yang terpulas fokal atau hanya setempat dari membran sitoplasma, intensitas sedang jika tampilan lemah atau moderate komplit pada membran sitoplasma pada ≥ 10 sel-sel tumor dan kuat jika tampilan kuat dan komplit pada membran sitoplasma ≥ 10 sel –sel tumor. • Kanker payudara merupakan keadaan malignansi yang berasal dari sel- sel yang terdapat pada payudara, dapat berasal dari bagian lobulus, duktus, lemak dan jaringan konektif, pembuluh darah dan limfe. Pada umumnya karsinoma berasal dari sel-sel yang terdapat pada duktus, beberapa diantaranya berasal dari lobulus dan jaringan lainnya. Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008 • Gambaran sitologi karsinoma duktus invasif terdiri dari sel-sel epitel yang tersebar dan sebagian membentuk kelompokan-kelompokan dengan inti besar, poligonal , NC rasio meningkat, tepi inti ireguler. Nukleoli mudah terlihat dan kadang-kadang multipel. Pada sediaan lain, sediaan hapus dapat terdiri dari sel-sel berukuran sedang, kohesi antar sel renggang dan monomorfik. Pada keadaan ini sering sel-sel tersebar secara tunggal. tidak dijumpai sel-sel mioepitel dan tidak dijumpai bare bipolar nuclei. • Gambaran sitologi karsinoma lobular invasif terdiri dari gambaran klasik dengan kecenderungan populasi sel yang sedikit. Sel-sel tersebar tunggal atau membentuk kelompokan kecil dengan karakteristik gambaran single files , sitoplasma sedikit, banyak dijumpai naked cells , inti irregular, hiperkromatik dan ukuran inti uniform, kadang-kadang inti eksentrik, sitoplasma banyak dan mengandung musin. • Gambaran sitologi karsinoma musinosum terdiri dari sel-sel epitel dengan bentuk atipik, membentuk agregat kecil yang solid dan ada juga yang tersebar membentuk files tunggal, inti membesar, pleomorfik, moderate atipia, dengan sitoplasma yang banyak. Latar belakang sediaan hapus didominasi oleh musin yang sangat menonjol dan secara makroskopis dapat terlihat. Pada beberapa kasus dapat dijumpai musin intrasitoplasmik dan signet ring cell , seperti pada karsinoma lobular invasif. Selain itu juga dapat dijumpai gambaran “chicken wire ” yang berasal dari pembuluh darah dan sangat prominen. Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008 • Gambaran sitologi karsinoma meduler terdiri dijumpai populasi sel banyak, sel-sel tersebar dalam bentuk kelompokan atau tunggal dengan kohesi antar sel yang rapuh. Sel-sel berukuran besar, berbentuk poligonal, inti membesar, pleomorfik, nukleoli prominen dengan latar belakang sel-sel limfosit yang banyak. • Sistosarkoma filoides maligna merupakan keganasan dari payudara yang berasal dari sel-sel stromal payudara. • Gambaran sitologi penyakit Paget terdiri sel-sel malignan dan membentuk tunggal atau kelompokan kecil, sitoplasma banyak dan pucat dengan batas tegas, dengan latar belakang sediaan hapus terdiri dari sel-sel epitel tatah, massa keratin, sel-sel radang dan debris. Kadang-kadang dapat dijumpai sel-sel dengan binukleasi. 3.7. Prosedur penelitian 3.7.1. Pengambilan sampel sitologi Peralatan dan lokasi pengambilan sampel sitologi Peralatan yang dgunakan adalah pistolet Comeco Swedia, spuit disposible10 ml, ukuran jarum 22 – 23 G, panjang 30 – 50 mm, kapas alkohol dan lokasi pengambilan pada payudara. Prosedur pengambilan sediaan sitologi 1. Kulit didesinfeksi, tanpa menggunakan anestesi, nodul atau tumor difiksasi diantara jari tangan, sambil kulit di atasnya diregangkan. Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008 Pada posisi piston tabung suntik di bagian distal, jarum diinsersi ke dalam massa tumor. 2. Piston semprit cepat ditarik dan tekanan negatif akan menyebabkan materi tertarik ke dalam jarum. 3. Jarum digerakkan dengan cepat ke muka dan ke belakang supaya materi cukup terisap. 4. Supaya jarum ditarik dari lesi, tekanan dalam semprit harus dibuat sama dengan tekanan diluar semprit dengan membiarkan melepaskan piston kembali sendirinya pada posisi terdahulu. 5. Sempit dengan jarum ditarik dari lesi. 6. Jarum dilepaskan dari semprit, piston ditempatkan pada bagian tengah semprit. 7. Jarum kembali diletakkan pada semprit dan aspirat yang ada di dalam ujung jarum disemprot diteteskan ke atas kaca objek dengan menekan piston. 18

3.7.2. Prosedur pewarnaan sitologi dengan Diff-Quik Stain Set

1. Celupkan sediaan ke dalam larutan fiksatif selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir. 2. Celupkan sediaan ke dalam larutan I selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir. 3. Celupkan sediaan ke dalam larutan I selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir. Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008 4. Cuci sediaan dengan air destilasi atau air diionisasi. 5. Keringkan dan siap untuk dibaca.

3.7.2. Prosedur kerja Imunositokimia HER2neu pada sediaan hapus

1. Buat sediaan hapus, fiksasi dalam metanol absolut. 2. Cuci dalam air mengalir selama 5 menit. 3. Bloking endogen peroksida metanol + H2O2 selama 30 menit. 4. Cuci dalam air mengalir selama 5 menit. 5. Pretreatment dengan Tris EDTA pada microwave : - Cook I, power level high selama 5 menit - Cook II, power level warm selama 5 menit Dinginkan selama lebih kurang 45 menit 6. Cuci dalam PBS pH 7,4 sebanyak 3x, masing-masing selama 5 menit. 7. Tandai populasi sel dengan Pap pen. 8. Teteskan antibodi primer dengan pengenceran 150, diamkan selama overnight . 9. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit atau sampai bersih. 10. Teteskan Envision plus, diamkan selama 30 – 45 menit. 11. Cuci dengan PBS pH 7,4 + Twin 20 selama 5 menit atau sampai bersih. 12. Teteskan kromogen DAB, diamkan selama 10 menit. 13. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit. 14. Counterstain dengan Hematoxyilin Mayers selama 5 – 10 menit. Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008 15. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit. 16. Masukkan ke dalam larutan litium karbonat jenuh 5 dalam akuades. 17. Birukan dalam air mengalir. 18. Dehidrasi alkohol 80, alkohol 96, alkohol absolut, alkohol absolut masing-masing selama 5 menit. 19. Clearing xylol I, xylol II, xylol III masing-masing selama 5 menit. 20 . Mounting , tutup dengan entelan. 21. Sediaan siap untuk dibaca. 3.8. Alat-alat penelitian dan bahan penelitian 3.8.1. Alat-alat penelitian Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah staining jar , rak object glass , rak inkubasi, pap pen, pipet mikro, timbangan bahan kimia,kertas saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung sentrifuge 15 ml, microwave , spin master , object glass , kaca penutup, entelan dan mikroskop cahaya.

3.8.2. Bahan penelitian

• Diff-Quik Stain Set Larutan Diff-Quik Stain Larutan fiksatif Triarylmethane dye, 100 PDC Methyl alcohol, dalam konsentrasi 0,002 gliter Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008 Larutan I Xanthene dye, 100 PDC Buffer Sodium azide, dalam konsentrasi 1,25 gliter Larutan II Thiazine dye mixture, 100 Buffer, dalam konsentrasi 1,25 gliter Penelitian ini menggunakan EnVision + Dual Link system-HRP DAB+ 284 dari DakoCytomation, terdiri dari: • 1 x 15 mL : Dual Endogenous Enzyme Block • 1 x 15 mL : Labelled Polymer-HRP • 1 x 18 mL : DAB+ Substrate Buffer • 1 x 1 mL : DAB+ Chromogen Antibodi HER2neu : HER2-pY 1248 Larutan PBS pH 7,4 Natrium klorida NaCl : 80 gram Kalium klorida : 2 gram Na2HPO4 : 11 gram KH2PO4 : 2 gram Tambahkan akuades add 1 liter Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008 Larutan litium karbonas 50 gram litium karbonas add akuades 1000 ml Larutan Tris HCL buffer 0,05 M pH 7,6 Nacl : 8,765 gram Tris : 6,1 gram Tris-hydroxy Methyl amino methane HCl pekat : 3 cc Add akuades 1 liter Larutan TRIS EDTA 0,01 M 9 Tris : 2,422 gram EDTA : 0,744 gram Add akuades 1 liter

3.9. Instrumen penelitian

Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pewarnaan imunositokimia HER2neu terhadap sampel sediaan sitologi dari payudara. Penilaian terhadap pulasan imunositokimia HER2neu adalah sebagai berikut : • Kontrol positif : karsinoma payudara yang telah diketahui positif terhadap HER2neu • Kontrol negatif : karsinoma payudara dengan antibodi primer yang digantikan dengan serum normal • Positif : warna coklat yang tertampil pada sitoplasma sel Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008 Perhitungan intensitas hasil pulasan imunositokimia HER2neu adalah sebagai berikut : • Skor 0 : negatif, tidak dijumpai sitoplasma sel yang terpulas atau sangat tipis dan ≤ 10 dari sel-sel tumor • Skor +1 : ≤ 10 sel yang terpulas fokal atau hanya setempat dari membran sitoplasma • Skor +2 : tampilan lemah atau moderate komplit pada membran sitoplasma pada ≥ 10 sel-sel tumor • Skor +3 : tampilan kuat dan komplit pada membran sitoplasma ≥ 10 sel –sel tumor 57 Tabel 3.1. Tampilan imunositokimia HER2neu pada sitologi kanker payudara Skor Kanker payudara Jumlah Imunositokimia + 1 + 2 + 3 Jumlah Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009 USU Repository © 2008

3.10. Teknik analisa data