BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Tempat dan waktu penelitian 3.1.1. Tempat penelitian
Penelitian ini dilakukan di Sentra Diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara serta kerjasama dengan laboratorium
patologi anatomi swasta di Medan.
3.1.2. Waktu penelitian
Penelitian dilakukan selama bulan Juni 2008 sampai Maret 2009 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan sampel, penelitian dan
penulisan.
3.2. Metode Rancangan
Rancangan penelitian ini menggunakan rancangan deskriptif dengan pendekatan
cross sectional .
58,59
Pada penelitian ini tidak memberikan perlakuan terhadap variabel tetapi hanya melihat hasil pulasan atau ekspresi
imunositokimia HER2neu. Pengukuran pada variabel hanya dilakukan satu kali dan pada satu saat.
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
3.3. Kerangka operasional
Kerangka operasional penelitian yang akan digunakan adalah sebagai berikut :
Massa pada payudara Aspirasi biopsi jarum halus
Karsinoma mamma C5 Imunositokima HER2neu
Penilaian hasil pulasan skor + 1
+ 2 + 3
Aspirasi biopsi jarum halus ulang
Gambar 3.1. Kerangka operasional penelitian
3.4. Populasi, sampel dan besar sampel penelitian 3.4.1. Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah sediaan hapus dari sitologi yang berasal dari payudara dan didiagnosa sebagai karsinoma mamma C5 pada semua
laboratorium patologi anatomi yang ada di kota Medan.
3.4.2. Sampel
Sampel dari penelitian ini adalah sediaan hapus dari sitologi yang berasal dari payudara yang memenuhi kriteria inklusi dan sesuai dengan besar sampel
penelitian.
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
3.4.3. Besar sampel penelitian
Perkiraan besarnya sampel penelitian berdasarkan perhitungan dengan menggunakan rumus :
N = Z
2
.P.1-P d
2
Keterangan : • N = jumlah populasi
• Z = tingkat kepercayaan 95 å 1,96 • P = proporsi hasil ekspresi pada lesi, 20 – 35
• d = ketepatan 0,2
Hasil perhitungan : N = 1,96 x 0,250.75
0,2
2
= 18,1 å 20 jumlah sampel minimal
3.5. Kriteria inklusi dan eksklusi 3.5.1. Kriteria inklusi
• Pasien wanita usia tanpa batasan usia. • Mempunyai benjolan pada payudara yang secara pemeriksaaan sediaan
hapus sitologi dengan pewarnaan Diff-Quik didiagnosa sebagai karsinoma mamma C5.
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
• Mempunyai riwayat keluarga dengan atau tanpa pernah mempunyai tumor payudara atau tumor ovarium.
3.5.2. Kriteria eksklusi
Yang termasuk kriteria eksklusi adalah : • Sediaan hapus sitologi dari payudara dengan pewarnaan Diff-Quik dan
didiagnosa bukan sebagai sebagai karsinoma mamma C5 • Sediaan sitologi dari payudara yang rusak dan tidak dapat diproses
dengan pulasan imunohistokimia HER2neu
3.6. Variabel penelitian dan definisi operasional 3.6.1. Variabel penelitian
Variabel yang diteliti adalah : • Variabel bebas adalah HER2neu
• Variabel terikat adalah lesi pada payudara
3.6.2. Definisi operasional
• HER2neu merupakan gen yang normal dan berfungsi untuk mengatur pertumbuhan Gen HER2neu bertanggung jawab untuk membuat protein
HER2 yang bekerja mengatur proses pertumbuhan dan pembelahan sel, terutama sel epitelial. Overekspresi akibat amplifikasi gen ini
menyebabkan peningkatan transkripsi pada mRNA dan translasi protein. HER2neu 50 mempunyai struktur homolog dengan EGFR dan
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
terdapat pada permukaan membran, transmembran dan sitoplasma
55
dan merupakan glikoprotein transmembran yang berperan sebagai kontrol pada pembelahan sel.
• Hasil pewarnaan imunositokimia pada HER2neu adalah tampilan warna coklat pada membran sitoplasma sel epitel yang dinyatakan dengan :
Negatif, bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana pada saat proses yang sama kontrol positif menampilkan warna yang sama dengan
pewarnaan kromogen DAB. Positif, bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada membran
sitoplasma sel dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x dan pada saat yang sama kontrol positif juga menampilkan warna
yang sama. Tampilan pulasan dapat memberikan intensitas lemah, jika ≤
10 sel yang terpulas fokal atau hanya setempat dari membran sitoplasma, intensitas sedang jika tampilan lemah atau moderate komplit
pada membran sitoplasma pada ≥ 10 sel-sel tumor
dan kuat jika tampilan kuat dan komplit pada membran sitoplasma
≥ 10 sel –sel tumor.
• Kanker payudara merupakan keadaan malignansi yang berasal dari sel- sel yang terdapat pada payudara, dapat berasal dari bagian lobulus,
duktus, lemak dan jaringan konektif, pembuluh darah dan limfe. Pada umumnya karsinoma berasal dari sel-sel yang terdapat pada duktus,
beberapa diantaranya berasal dari lobulus dan jaringan lainnya.
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
• Gambaran sitologi karsinoma duktus invasif terdiri dari sel-sel epitel yang tersebar dan sebagian membentuk kelompokan-kelompokan dengan inti
besar, poligonal , NC rasio meningkat, tepi inti ireguler. Nukleoli mudah terlihat dan kadang-kadang multipel. Pada sediaan lain, sediaan hapus
dapat terdiri dari sel-sel berukuran sedang, kohesi antar sel renggang dan monomorfik. Pada keadaan ini sering sel-sel tersebar secara tunggal.
tidak dijumpai sel-sel mioepitel dan tidak dijumpai bare bipolar nuclei.
• Gambaran sitologi karsinoma lobular invasif terdiri dari gambaran klasik dengan kecenderungan populasi sel yang sedikit. Sel-sel tersebar
tunggal atau membentuk kelompokan kecil dengan karakteristik gambaran
single files , sitoplasma sedikit, banyak dijumpai
naked cells ,
inti irregular, hiperkromatik dan ukuran inti uniform, kadang-kadang inti eksentrik, sitoplasma banyak dan mengandung musin.
• Gambaran sitologi karsinoma musinosum terdiri dari sel-sel epitel dengan bentuk atipik, membentuk agregat kecil yang solid dan ada juga
yang tersebar membentuk files
tunggal, inti membesar, pleomorfik, moderate
atipia, dengan sitoplasma yang banyak. Latar belakang sediaan hapus didominasi oleh musin yang sangat menonjol dan secara
makroskopis dapat terlihat. Pada beberapa kasus dapat dijumpai musin intrasitoplasmik dan
signet ring cell , seperti pada karsinoma lobular
invasif. Selain itu juga dapat dijumpai gambaran “chicken wire
” yang berasal dari pembuluh darah dan sangat prominen.
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
• Gambaran sitologi karsinoma meduler terdiri dijumpai populasi sel banyak, sel-sel tersebar dalam bentuk kelompokan atau tunggal dengan
kohesi antar sel yang rapuh. Sel-sel berukuran besar, berbentuk poligonal, inti membesar, pleomorfik, nukleoli prominen dengan latar
belakang sel-sel limfosit yang banyak. • Sistosarkoma filoides maligna merupakan keganasan dari payudara
yang berasal dari sel-sel stromal payudara. • Gambaran sitologi penyakit Paget terdiri sel-sel malignan dan
membentuk tunggal atau kelompokan kecil, sitoplasma banyak dan pucat dengan batas tegas, dengan latar belakang sediaan hapus terdiri
dari sel-sel epitel tatah, massa keratin, sel-sel radang dan debris. Kadang-kadang dapat dijumpai sel-sel dengan binukleasi.
3.7. Prosedur penelitian 3.7.1. Pengambilan sampel sitologi
Peralatan dan lokasi pengambilan sampel sitologi
Peralatan yang dgunakan adalah pistolet Comeco Swedia, spuit disposible10 ml, ukuran jarum 22 – 23 G, panjang 30 – 50 mm, kapas alkohol dan lokasi
pengambilan pada payudara.
Prosedur pengambilan sediaan sitologi
1. Kulit didesinfeksi, tanpa menggunakan anestesi, nodul atau tumor difiksasi diantara jari tangan, sambil kulit di atasnya diregangkan.
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
Pada posisi piston tabung suntik di bagian distal, jarum diinsersi ke dalam massa tumor.
2. Piston semprit cepat ditarik dan tekanan negatif akan menyebabkan materi tertarik ke dalam jarum.
3. Jarum digerakkan dengan cepat ke muka dan ke belakang supaya materi cukup terisap.
4. Supaya jarum ditarik dari lesi, tekanan dalam semprit harus dibuat sama dengan tekanan diluar semprit dengan membiarkan melepaskan
piston kembali sendirinya pada posisi terdahulu. 5. Sempit dengan jarum ditarik dari lesi.
6. Jarum dilepaskan dari semprit, piston ditempatkan pada bagian tengah semprit.
7. Jarum kembali diletakkan pada semprit dan aspirat yang ada di dalam ujung jarum disemprot diteteskan ke atas kaca objek dengan menekan
piston.
18
3.7.2. Prosedur pewarnaan sitologi dengan Diff-Quik Stain Set
1. Celupkan sediaan ke dalam larutan fiksatif selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir.
2. Celupkan sediaan ke dalam larutan I selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir.
3. Celupkan sediaan ke dalam larutan I selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir.
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
4. Cuci sediaan dengan air destilasi atau air diionisasi. 5. Keringkan dan siap untuk dibaca.
3.7.2. Prosedur kerja Imunositokimia HER2neu pada sediaan hapus
1. Buat sediaan hapus, fiksasi dalam metanol absolut. 2. Cuci dalam air mengalir selama 5 menit.
3. Bloking endogen peroksida metanol + H2O2 selama 30 menit. 4. Cuci dalam air mengalir selama 5 menit.
5. Pretreatment
dengan Tris EDTA pada microwave
: -
Cook I, power level high selama 5 menit
- Cook II, power level warm
selama 5 menit Dinginkan selama lebih kurang 45 menit
6. Cuci dalam PBS pH 7,4 sebanyak 3x, masing-masing selama 5 menit.
7. Tandai populasi sel dengan Pap pen. 8. Teteskan antibodi primer dengan pengenceran 150, diamkan selama
overnight .
9. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit atau sampai bersih. 10. Teteskan Envision plus, diamkan selama 30 – 45 menit.
11. Cuci dengan PBS pH 7,4 + Twin 20 selama 5 menit atau sampai bersih.
12. Teteskan kromogen DAB, diamkan selama 10 menit. 13. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit.
14. Counterstain
dengan Hematoxyilin Mayers selama 5 – 10 menit.
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
15. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit. 16. Masukkan ke dalam larutan litium karbonat jenuh 5 dalam
akuades. 17. Birukan dalam air mengalir.
18. Dehidrasi alkohol 80, alkohol 96, alkohol absolut, alkohol absolut masing-masing selama 5 menit.
19. Clearing
xylol I, xylol II, xylol III masing-masing selama 5 menit. 20
. Mounting , tutup dengan entelan.
21. Sediaan siap untuk dibaca.
3.8. Alat-alat penelitian dan bahan penelitian 3.8.1. Alat-alat penelitian
Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah staining jar
, rak object
glass , rak inkubasi, pap pen, pipet mikro, timbangan bahan kimia,kertas saring,
pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung sentrifuge
15 ml, microwave
, spin master
, object glass
, kaca penutup, entelan dan mikroskop cahaya.
3.8.2. Bahan penelitian
• Diff-Quik Stain Set
Larutan Diff-Quik Stain Larutan fiksatif
Triarylmethane dye, 100 PDC Methyl alcohol, dalam konsentrasi 0,002 gliter
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
Larutan I Xanthene dye, 100 PDC
Buffer Sodium azide, dalam konsentrasi 1,25 gliter
Larutan II Thiazine dye mixture, 100
Buffer, dalam konsentrasi 1,25 gliter
Penelitian ini menggunakan EnVision
+ Dual Link system-HRP
DAB+ 284 dari DakoCytomation, terdiri dari:
• 1 x 15 mL : Dual Endogenous Enzyme Block • 1 x 15 mL : Labelled Polymer-HRP
• 1 x 18 mL : DAB+ Substrate Buffer • 1 x 1 mL : DAB+ Chromogen
Antibodi HER2neu : HER2-pY 1248
Larutan PBS pH 7,4 Natrium klorida NaCl
: 80 gram Kalium klorida
: 2 gram Na2HPO4
: 11
gram KH2PO4
: 2 gram Tambahkan akuades add 1 liter
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
Larutan litium karbonas 50 gram litium karbonas add akuades 1000 ml
Larutan Tris HCL buffer 0,05 M pH 7,6 Nacl
: 8,765 gram Tris
: 6,1 gram Tris-hydroxy Methyl amino methane HCl pekat
: 3 cc Add akuades 1 liter
Larutan TRIS EDTA 0,01 M 9 Tris
: 2,422
gram EDTA
: 0,744
gram Add akuades 1 liter
3.9. Instrumen penelitian
Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pewarnaan imunositokimia HER2neu terhadap sampel sediaan sitologi dari payudara. Penilaian terhadap
pulasan imunositokimia HER2neu adalah sebagai berikut : • Kontrol positif : karsinoma payudara yang telah diketahui positif terhadap
HER2neu • Kontrol negatif : karsinoma payudara dengan antibodi primer yang
digantikan dengan serum normal • Positif : warna coklat yang tertampil pada sitoplasma sel
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
Perhitungan intensitas hasil pulasan imunositokimia HER2neu adalah sebagai berikut :
• Skor 0 : negatif, tidak dijumpai sitoplasma sel yang
terpulas atau sangat tipis dan ≤ 10 dari sel-sel
tumor • Skor +1
: ≤ 10 sel yang terpulas fokal atau hanya
setempat dari membran sitoplasma • Skor +2
: tampilan lemah atau moderate komplit pada membran sitoplasma pada
≥ 10 sel-sel tumor • Skor +3
: tampilan kuat dan komplit pada membran sitoplasma
≥ 10 sel –sel tumor
57
Tabel 3.1. Tampilan imunositokimia HER2neu pada sitologi kanker payudara
Skor Kanker payudara
Jumlah Imunositokimia
+ 1
+ 2
+ 3
Jumlah
Reno Keumalazia Kamarlis : Tampilan imunositokimia HER2neu pada biopsi aspirasi jarum halus penderita kanker payudara, 2009
USU Repository © 2008
3.10. Teknik analisa data