Metode Rancangan Kerangka Operasional Instrumen Penelitian

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat Dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di Sentra Diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU di Medan dan kerjasama dengan Laboratorium Sandia di Rumah Sakit Santosa Bandung.

3.1.2. Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan mulai Januari 2006 hingga Oktober 2007 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan sampel, penelitian serta penulisan.

3.2. Metode Rancangan

Rancangan penelitian ini adalah rancangan observasional dengan pendekatan cross sectional . 46 Dalam penelitian ini tidak memberikan perlakuan terhadap variabel, namun hanya melihat hasil pulasan imunohistokimia COX-2. Pengukuran variabelnya dilakukan hanya satu kali dan pada satu saat. Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008.

3.3. Kerangka Operasional

Rancangan penelitian yang digunakan dapat digambarkan seperti gambar berikut ini: Blok parafin Lab.PA FK-USU prak.swasta Kriteria inklusi Lemah Sedang Kuat Karsinoma Gastritis Lesi pre-kanker Lemah Lemah Sedang Sedang Kuat Imunohistokimia Cox-2 Gastritis G..atrofi Metaplasia Intestinal Displasia Karsinoma lambung Kuat Gambar 3.1. Kerangka Operacional 3.4. Populasi, Sampel Dan Besar Sampel Penelitian 3.4.1. Populasi Populasi dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin yang berasal dari biopsi lambung yang didiagnosa sebagai gastritis, gastritis atrofi, metaplasia intestinal, displasia dan karsinoma lambung pada Sentra Diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU di Medan.

3.4.2. Sampel

Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari biopsi lambung yang sesuai dengan kriteria inklusi dan sesuai besar sampel penelitian. Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008.

3.4.3. Besar Sampel Penelitian

Perkiraan besarnya sampel penelitian berdasarkan perhitungan dengan menggunakan rumus 47 : n = Za 2 .p1-p d 2 Keterangan : • n = jumlah populasi • Za = tingkat kepercayaan 95 å Z-score = 1,96 • p = proporsi seluruh lesi, bila tidak ada dianggap 50 atau 0,5 • d = ketepatan 1,5 Hasil perhitungan : n = 1,96 2 x 0,5 x 0,5 1,5 2 = 42,6 Maka jumlah sampel ditetapkan sebesar 43 sediaan blok parafin. Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008. 3.5. Kriteria Inklusi Dan Eksklusi 3.5.1. Kriteria Inklusi • Yang termasuk kriteria inklusi adalah semua sediaan blok parafin jaringan biopsi lambung dengan pulasan Hematoksilin-Eosin didiagnosa sebagai gastritis, gastritis atrofi, metaplasia intestinal, displasia ringan dan berat serta karsinoma lambung.

3.5.2. Kriteria Eksklusi

Yang termasuk kriteria eksklusi adalah : • Sediaan blok parafin jaringan biopsi lambung yang bukan didiagnosa sebagai gastritis, gastritis atrofi, metaplasia intestinal, displasia ringan dan berat serta karsinoma lambung dengan pulasan Hematoksilin-Eosin. • Sediaan parafin blok yang rusak dan tidak dapat diproses lebih lanjut dengan pulasan imunohistokimia COX -2 3.6. Variabel Penelitian Dan Definisi Operasional 3.6.1. Variabel Penelitian Variabel yang menjadi perhatian di dalam penelitian ini yaitu : • Variabel bebas adalah COX -2 • Variabel terikat adalah lesi pada lambung Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008.

3.6.2. Definisi Operasional Variabel

• COX -2 adalah suatu enzim Cyclooxygenase isoform yang diinduksi untuk mengubah asam arakidonat menjadi prostanoid. COX-2 berperanan mensintesa Prostaglandin E2 PgE2, merangsang Bcl - 2 dan dapat menghambat apoptosis serta menyokong IL-6 dalam mensintesa Haptoglobin. • Hasil pulasan imunohistokimia COX-2 adalah tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel epitel yang dinyatakan: • Negatif, bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana pada saat proses yang sama kontrol + menampilkan warna coklat dengan pewarnaan kromogen DAB . • Positif, bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x pada 5 lokasi lapangan pandang dan pada saat yang sama kontrol + juga menampilkan warna yang sama. Perhitungan luas hasil pulasan imunohistokimia COX-2 adalah sebagai berikut : • Skor 0 : negatif • Skor 1 tampilan lemah : 10 sel yang terpulas fokal • Skor 2 tampilan sedang : 10-49 sel epitel yang terpulas fokal • Skor 3 tampilan kuat : ≥50 sel epitel yang terpulas difus. Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008. • Sel epitel yang dinilai terbagi atas 2 jenis yaitu sel epitel foveolar permukaan dan sel epitel kelenjar. • Sel epitel foveolar permukaan adalah sel epitel mukus yang melapisi permukaan dan foveolar lambung, sedangkan sel epitel kelenjar adalah sel yang melapisi kelenjar yang terletak di bawah dari yang kami sebutkan di atas. • Yang dimaksud dengan variabel lesi jinak lambung yaitu gastritis kronik. Gastritis kronik adalah peradangan kronik pada lapisan mukosa lambung yang ditandai dengan adanya sebukan sel radang pada lapisan mukosa lambung, kadang dapat dijumpai kelompokan kecil limfoid di dekat muskularis mukosa, namun pada lamina propria tidak ditemukan. 1,23,31 • Yang dimaksud dengan variabel lesi pre-kanker lambung adalah gastritis atrofi, metaplasia intestinal dan displasia. • Gastritis atrofi adalah penipisan mukosa lambung disertai hilangnya kelenjar karena jejas mukosa yang berulang dan kronis. • Metaplasia intestinal adalah perubahan morfologi maupun histokimia sel kolumner penghasil mukus pada lambung menjadi sel goblet dan sel absorpsi seperti yang dijumpai pada usus. 1,23 • Displasia adalah perubahan neoplastik pada sel epitel lambung, berupa peningkatan proliferasi, ukuran, konfigurasi serta orientasi sel yang masih terbatas pada epitel. Dalam penelitian ini, displasia Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008. dikelompokan dengan menggunakan sistem 2 tingkatan yaitu displasia ringan low grade dan displasia berat high grade . • Displasia ringan adalah perubahan sel yang hanya terjadi pada superfisial, lumen kelenjar bentuk tubulus sederhana tanpa percabangan kompleks. Letak inti terbatas pada ½ basal sel aktifitas mitosis hanya sedikit. • Displasia berat adalah perubahan bentuk kelenjar dengan lumen bentuk tubuler yang ireguler, kadang berbetuk cribriform maupun bercabang. Inti ½ basal sel, aktifitas mitosis banyak dijumpai. Displasia berat ini beresiko menjadi karsinoma lambung tipe intestinal. Lesi-lesi pre-kanker ini sering dijumpai secara bersamaan. Bila ditemukan beberapa lesi pre-kanker secara bersamaan, maka diagnosa dikelompokkan ke dalam variabel yang merupakan tingkatan lesi yang lebih berat. Pada penelitian ini bila dijumpai gastritis atrofi bersamaan dengan metaplasia, maka kami kelompokan ke dalam variabel metaplasia inteatinal. Demikian juga displasia yang ditemukan pada sel epitel kelenjar yang mengalami atrofi serta pada metaplasia intestinal, maka lesi tersebut dikelompokan ke dalam variabel displasia. Dan pada penelitian ini, untuk variabel lesi pre- kanker akan lebih difokuskan pada lesi displasia lambung. Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008. • Variabel lesi kanker lambung yang dimaksud dalam penelitian ini mencakup kelainan keganasan lambung berupa karsinoma lambung tipe intestinal, karsinoma in-situ serta karsinoma dini lambung KDL. • Karsinoma lambung tipe intestinal adalah tumor ganas epitel mukosa lambung dengan diferensiasi kelenjar. 4 • Karsinoma dini lambung early gastric cancer adalah tumor ganas epitel yang masih terbatas pada mukosa dan sub-mukosa lambung, tidak menginvasif dinding otot, tanpa memperhatikan ada atau tidaknya metastase pada kelenjar getah bening di sekitar lambung. • Karsinoma in-situ adalah sel-sel tumor ganas masih terbatas pada epitel, belum menginvasif melewati lapisan basal membran dan belum mengadakan metastasis 2,4,5,15 3.7. Prosedur Penelitian 3.7.1. Pembuatan Sediaan Mikroskopis Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut : 1. Blok paraffin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer sampai cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4 m. Setiap blok parafin, dipotong ulang 1 kali untuk pulasan imunohistokimia COX-2. 2. Sampel blok parafin yang sudah dipotong tipis 4 m, selanjutnya ditempelkan pada objek gelas. Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008. Pada pulasan imunohistokimia COX-2 digunakan kaca objek yang telah di- coating agar jaringan dapat menempel pada kaca objek selama proses pulasan imunohistokimia. Proses pembuatan coating kaca objek gelas adalah sebagai berikut: 1. Kaca objek direndam seluruhnya dalam Aseton selama 10 menit 2. Masukkan dalam larutan APES 3- aminopropyltriethoxysilene, cat no.A 3548 sigma 5 mL + aseton 195 mL selama 10 menit 3. Kaca objek selanjutnya dicuci dengan akuades 4. Keringkan dalam inkubator bersuhu 37 C selama semalam 5. Kaca objek siap digunakan Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing, potongan-potongan tipis dipisahkan dan diratakan dengan memasukkan potongan tersebut dalam air hangat, setelah mengembang pindahkan ke objek gelas. Selanjutnya, kaca objek yang mengandung potongan jaringan diletakkan di atas alat pemanas hot plate atau dimasukkan dalam air panas floating bath dengan temperatur 50-60 C. Setelah parafin melunak karena panas, potongan jaringan diletakkan dalam kaca objek kembali dan dikeringkan dengan cara menyandarkan pada alat pemanas. Setelah kering, potongan jaringan siap untuk dipulas. Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008.

3.7.2. Prosedur Pulasan Imunohistokimia COX-2

1. Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4µm yang sudah ditempelkan pada objek gelas yang telah di coating 2. Preparat yang siap dipulas dimasukkan dalam inkubator 1 malam, suhu 38 C 3. Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat kedalam cairan xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit 4. Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam Etanol 98 sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, Alkohol 90, 80 dan 70, masing-masing selama 5 menit. 5. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit 6. Masukkan kedalam H 2 O 2 0,3 dalam Metanol dingin selama 15 menit 7. Bilas dengan akuades selama 5 menit 8. Masukkan kedalam larutan Bufer Sitrat yang telah dipanaskan sebelumnya dalam microwave selama 5’ - 2 x 5’ 9. Dinginkan selama 20 menit dalam suhu ruangan 10. Bilas dengan akuades selama 5 menit dan keringkan air di sekitar potongan jaringan 11. Tandai disekeliling potongan jaringan yang ingin dipulas dengan Pap pen 12. Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit 13. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 14. Teteskan blocking serum pada sediaan yang telah ditandai dengan Pap pen selama 5 menit Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008. 15. Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit 16. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 17. Teteskan antibodi primer anti COX-2 dengan pengenceran 1:50, inkubasi dalam tempat tertutup dengan suhu ruangan selama 60 menit 18. Bilas dalam larutan PBS sebanyak dua kali, masing-masing selama 5 menit 19. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 20. Teteskan dengan antibodi sekunder, Biotinylated Universal , inkubasi dalam tempat tertutup dengan suhu ruangan selama 10 menit 21. Bilas dalam larutan PBS sebanyak dua kali, masing-masing selama 5 menit 22. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 23. Teteskan dengan steptavidin-peroxidase conjugate , inkubasi dalam tempat tertutup pada suhu ruangan selama 10 menit 24. Bilas dalam larutan PBS sebanyak dua kali, masing-masing selama 5 menit 25. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 26. Teteskan larutan kromogen DAB selama 5-10 menit 27. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit 28. Counterstain dengan hematoksilin Mayer selama 2 menit 29. Bilas dengan air mengalir 30. Dehidrasi dengan cara : celupkan secara berurutan pada cairan alkohol 70, 80, 90 dan etanol 98 masing-masing 20 celup Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008. 31. Masukkan dalam cairan xylol selama 3 menit 32. Teteskan entelan dan tutup dengan kaca penutup 3.8. Alat Dan Bahan Penelitian 3.8.1 . Alat-alat Penelitian Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah: mikrotom, waterbath , hot plate , freezer, inkubator, staining jar , rak objek glass, rak imkubasi, pensil Diamond , pipet mikro, timbangan bahan kimia, kertas saring, pengukur waktu, gelas Erlenmenyer , gelas beker, tabung sentrifuge 15 ml, microwave , Spin master , thermolyte stirrer , gelas objek, kaca penutup , Entelan dan mikroskop cahaya.

3.8.2. Bahan Penelitian

• Blok parafin yang telah didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin sebagai gastritis kronik, gastritis atrofi, metaplasma intestinal, displasia serta karsinoma lambung. • Pulasan imunohistokimia menggunakan metode Labelled Streptavidin Biotin Immunoperoxidase Complex , menggunakan Novostain Universal Detection Kit NCL-RTU-D Novocastra , Inggris. Antibodi primer yang digunakan adalah Lyophilisised monoclonal antibody NCL-COX2, clone 4H12 Novocastra, Inggris , dengan pengenceran 1: 50. Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008. Novostain Universal Detection Kit NCL-RTU-D terdiri dari: 1. 1 botol blocking serum 2. 1 botol Biotinylated universal secondary antibody 3. 1 botol Streptavidin-peroxidase conjugate Larutan kromogen DAB yang digunakan adalah Liquid DAB substrate kit NCL-L-DAB Novocastra, Inggris: 3, 3’- diaminobenzidine. Larutan PBS phosphate buffered saline pH 7,2 ; terdiri dari : • Na 2 HPO 4 1, 92 g • Na2H 2 PO4h 2 O 1, 92 g • NaCl 5, 90 g • Dalam akuades 1,0 L Larutan Bufer Sitrat sodium citrate buffer pH 6,0 terdiri dari : • 1,92 g Citric acid dalam akuades 1 L • 0,5 mL Tween 20 • Counterstain dengan menggunakan Hematoksilin Mayer.

3.9. Instrumen Penelitian

Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pulasan imunohistokimia COX-2 terhadap sampel sediaan jaringan biopsi lambung. Untuk penilaian terhadap pulasan imunohistokimia COX-2 adalah sebagai berikut : Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008. • Kontrol positif : karsinoma payudara yang telah diketahui positif terhadap COX-2 . • Kontrol negatif : karsinoma lambung dengan antibody primer yang digantikan dengan serum normal. • Positif : warna coklat yang tertampil pada sitoplasma sel Menurut Saukkonen dkk. perhitungan luas hasil pulasan imunohistokimia COX-2 adalah sebagai berikut 43 : • Skor O : negatif • Skor 1 : 10 sel yang terpulas fokal • Skor 2: 10-49 sel yang terpulas fokal • Skor 3: ≥50 sel yang terpulas difus Sel-sel tumor dengan skor 0 dinilai sebagai tampilan negatif, skor 1 dinilai sebagai tampilan lemah, skor 2 dinilai sebagai tampilan sedang dan skor 3 dinilai sebagai tampilan kuat. Tabel 3.1. Luas tampilan imunohistokimia COX-2 pada lesi gastritis, pre-kanker dan kanker pada lambung Lesi Pre-kanker Jinak Displasia Skor Gastritis GA MI Ringan Berat Karsi- noma Jumlah 1+ 2+ Imunohi stokimia COX-2 3+ Jumlah Betty : Tampilan Imunohistokimia COX-2 pada Lesi Gastritis, Pre-Kanker dan Kanker Lambung. USU e-Repository © 2008. Keterangan : Tampilan COX -2 • 0 = Negatif • 1 = Lemah 10 sel yang positif • 2 = Sedang 10-49 sel yang positif • 3 = Kuat ≥50 sel yang positif

3.10. Teknik Analisis Data