Jumlah total sel yang diperlukan Volume panenan sel =
Jumlah sel terhitung mL Ambil volume panenan sel, transfer ke tabung konikel baru kemudian tambahkan
MK sampai total volume yang diperlukan CCRC, 2009.
3.10 Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak sampel uji ditimbang sebanyak 5 mg dalam polytube, kemudian dilarutkan dalam dimetilsulfoksida DMSO sebanyak 100 µL, divortex agar sampel
terlarut sempurna kemudian dicukupkan dengan MK-RPMI, kemudian dibuat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 500 µgmL,
250 µgmL, 125 µgmL, 62,5 µgmL, dan 31,25 µgmL semua pengenceran dilakukan dengan menggunakan MK CCRC, 2009.
3.11 Pengujian Sitotoksik
Pengujian sitotoksik meliputi pengujian terhadap sel Vero dan sel T47D yang selanjutnya dikonversi ke dalam persen sel hidup dan dianalisis dengan SPSS 19 lalu
dihitung indeks selektivitasnya.
3.11.1 Pengujian sitotoksik terhadap sel Vero
Endapan sel Vero disuspensikan pada media M199 dan ditentukan kerapatan sel sebesar 2 x 10
5
selmL. Suspensi sel dibagi ke dalam sumuran-sumuran yang tiap sumuran sebanyak 100 µm suspensi dan kemudian ditambahkan ke dalamnya larutan
atau suspensi ekstrak sampel uji dalam berbagai konsentrasi yang selanjutnya disebut sampel. Pada kontrol positif yang ditambahkan adalah larutan doksorubisin juga
dalam berbagai kadar sedangkan pada kontrol negatif adalah media M199. Sampel
Universitas Sumatera Utara
diinkubasi sampai pertumbuhan sel konfluen. Pada tiap sumuran ditambahkan 100 μL media kultur RPMI dan 10 μL MTT Sigma konsentrasi 5 mgmL. Sel
diinkubasi kembali selama 4 – 6 jam dalam inkubator CO
2
5 bersuhu 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, lalu plate
dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama satu malam pada suhu kamar. Serapan dibaca dengan ELISA reader Bencmark Bio Rad pada panjang
gelombang 595 nm Handayani, et al., 2001; Adina, 2009.
3.11.2 Pengujian sitotoksik terhadap sel T47D
Sel T47D ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1x10
4
selsumuran dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
5 bersuhu 37
o
C selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan
yang baru kemudian ditambahkan ekstrak sampel uji berbagai konsentrasi dengan co-solvent DMSO Sigma dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci
dengan PBS Sigma. Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μL media
kultur RPMI dan 10 μL MTT Sigma konsentrasi 5 mgmL. Sel diinkubasi kembali
selama 4 – 6 jam dalam inkubator CO
2
5 bersuhu 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, lalu plate dibungkus agar
tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama satu malam pada suhu kamar. Serapan dibaca dengan ELISA reader Bencmark Bio Rad pada panjang gelombang 595 nm
Adina, 2009.
3.11.3 Analisis hasil
Berdasarkan data absorbansi yang diperoleh dari uji sitotoksik, sel dikonversi ke dalam persen sel hidup. Persen sel hidup dihitung menggunakan rumus:
Universitas Sumatera Utara
Aktivitas sitotoksik dinyatakan dengan IC
50
konsentrasi yang menyebabkan kematian 50 populasi sel yang dianalisis dengan analisis probit menggunakan
SPSS CCRC, 2009.
3.11.4 Indeks Selektivitas
Indeks selektivitas diperoleh dari rasio IC
50
sel Vero sel dibandingkan dengan
sel kanker yang diuji sel T47D. Indeks selektivitas dihitung menggunakan
persamaan di bawah ini: Weerapreeyakul, et al., 2012 IC
50
sel Vero Indeks selektivitas =
IC
50
sel T47D
3.12
Uji Kombinasi Ekstrak Buah Andaliman dengan Doksorubisin terhadap Sel T47D
Kultur sel yang digunakan dalam kondisi 70 – 80 konfluen untuk dipanen. Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji kombinasi adalah 1 x 10
4
selsumuran 1 x 10
4
sel100 µL MK. Lalu dibuat pengenceran suspensi sel sehingga konsentrasi sel akhir 1x10
4
sel100 µL MK. Ditransfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 µL. Setiap kali mengisi 12 sumuran, resuspensi sel agar tetap homogen. Sebanyak 3
sumuran kosong disisakan untuk kontrol media. Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Sel diinkubasikan ke dalam inkubator selama 24 jam.
Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel dan agen kemoterapi doksorubisin untuk perlakuan. Seri konsentrasi ekstrak terdiri dari 4 konsentrasi: ½;
3 8
;
1 4
;
1 8
IC
50
. Seri konsentrasi doksorubisin terdiri dari 4 konsentrasi: ½;
1 4
;
1 8
;
1 16
IC
50
. Diambil plate yang telah berisi sel dari inkubator. Media sel dibuang dengan
Universitas Sumatera Utara
cara membalikkan plate 180° di atas tempat buangan, kemudian plate ditekan secara perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan. Sel dicuci dalam sumuran
dengan masing-masing 100 µL PBS. PBS dibuang, ditiriskan sisa cairan dengan tisu. Pada kelompok perlakuan kombinasi, dimasukkan seri konsentrasi sampel ke
dalam sumuran masing-masing 50 µL dengan replikasi 3 kali triplo, kemudian ditambahkan seri konsentrasi doksorubisin untuk kombinasi masing-masing 50 µL.
Pada kelompok perlakuan tunggal, dimasukkan seri konsentrasi sampel atau doksorubisin ke dalam sumuran masing-masing 50 µL dengan replikasi 3 kali
triplo, kemudian ditambahkan MK masing-masing 50 µL ke dalam sumuran. Untuk kontrol sel, ditambahkan MK ke dalam sumuran yang berisi sel
masing-masing 100 µL dengan replikasi 3 kali triplo. Untuk kontrol media, ditambahkan MK ke dalam sumuran yang kosong tanpa sel masing-masing 100 µL
dengan replikasi 3 kali triplo. Diinkubasi di dalam inkubator CO
2
. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap sel. Jika dalam waktu 24 jam belum terlihat
efek sitotoksik, diinkubasikan kembali selama 24 jam waktu inkubasi total 24 – 48 jam. Dibuat stok MTT 5 mgmL dengan cara penimbangan 50 mg serbuk MTT,
dilarutkan dalam 10 µL PBS dengan bantuan vortex. Dibuat reagen MTT untuk perlakuan 0,5 mgmL dengan cara diambil 1 mL stok MTT 5 mgmL dan
diencerkan dengan MK ad 10 mL. Reagen ini dibuat untuk 1 buah 96 well plate. Media sel dibuang lalu dicuci masing-masing dengan 1
00 μL PBS 1x. Ditambahkan 100 µL reagen MTT 0,5 mgmL 100 µL ke setiap sumuran, termasuk kontrol media
tanpa sel. Diinkubasikan sel selama 2 – 4 jam di dalam inkubator sampai terbentuk kristal formazan yang ungu. Setelah 2 – 4 jam, kondisi sel diperiksa dengan inverted
microscope. Jika formazan telah jelas terbentuk, ditambahkan stopper SDS 10
Universitas Sumatera Utara
dalam HCl 0,1 N. Plate dibungkus dengan kertas atau alumunium foil dan diinkubasikan di tempat gelap dan suhu kamar selama semalam. Keesokan harinya,
plate di-shaker selama 10 menit untuk melarutkan formazan. ELISA reader dihidupkan dan ditunggu proses progressing hingga selesai. Pembungkus plate
dibuka dan plate ditutup. Lalu dimasukkan ke dalam ELISA reader. Dibaca absorbansi pada masing-masing sumuran dengan ELISA reader
dengan λ= 550 – 600 nm λ= 595 nm dengan cara tekan tombol START. Setelah semua sumuran dibaca, tekan tombol STOP dan ELISA reader dimatikan. Setiap kali
pembacaan di ELISA reader, dicatat di buku catatan pemakaian ELISA reader. Presentase sel hidup dihitung. Dihitung harga IK Indeks Kombinasi Nugroho, et
al., 2013.
3.13 Pengujian Kombinasi Ekstrak Buah Andaliman dengan Doksorubisin
