dalam HCl 0,1 N. Plate dibungkus dengan kertas atau alumunium foil dan diinkubasikan di tempat gelap dan suhu kamar selama semalam. Keesokan harinya,
plate di-shaker selama 10 menit untuk melarutkan formazan. ELISA reader dihidupkan dan ditunggu proses progressing hingga selesai. Pembungkus plate
dibuka dan plate ditutup. Lalu dimasukkan ke dalam ELISA reader. Dibaca absorbansi pada masing-masing sumuran dengan ELISA reader
dengan λ= 550 – 600 nm λ= 595 nm dengan cara tekan tombol START. Setelah semua sumuran dibaca, tekan tombol STOP dan ELISA reader dimatikan. Setiap kali
pembacaan di ELISA reader, dicatat di buku catatan pemakaian ELISA reader. Presentase sel hidup dihitung. Dihitung harga IK Indeks Kombinasi Nugroho, et
al., 2013.
3.13 Pengujian Kombinasi Ekstrak Buah Andaliman dengan Doksorubisin
terhadap Apoptosis dan Siklus Sel Sel T47D
Pengujian apoptosis dan siklus sel menggunakan metode flow cytometry. Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji apoptosis adalah sebanyak 5 x 10
5
– 1 x 10
6
selsumuran yang kemudian ditanam pada microplate 6 sumuran, lalu diinkubasi selama 24 jam. Keesokan harinya sel ditambahkan sampel uji lalu diinkubasi
kembali selama 24 jam. Kemudian diambil media pada masing-masing sumuran pada tiap konsentrasi lalu dimasukkan dalam tabung konikel 15 mL lalu media dicuci 1 x
dengan PBS dan dibuang. Ditambahkan tripsin 250 µL pada tiap sumuran lalu diinkubasi selama 3 menit pada suhu 37
o
C pastikan di bawah mikroskop sel tidak menggerombol satu sama lain untuk mendapatkan hasil yang maksimal. Setelah itu,
ditambahkan 1 mL media kultur lalu media ditampung pada tabung konikel 15 mL. Disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 5 menit dan supernatannya
Universitas Sumatera Utara
dibuang. Lalu ditambahkan sebanyak 1 mL PBS kemudian media dipindahkan ke dalam tabung konikel 1,5 mL dan disentrifugasi lagi dengan kecepatan 2000 rpm
selama 3 menit, setelah itu supernatannya dibuang. Untuk pengujian apoptosis ditambahkan Annexin V dan propidium iodida, sedangkan pengujian siklus sel
ditambahkan propidium iodida. Lalu diukur dengan alat flow cytometer Hostanska, et al., 2004.
3.14 Pengujian Kombinasi Ekstrak Buah Andaliman dengan Doksorubisin
dalam Penghambatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Cox-2 terhadap Sel T47D
Analisis penghambatan ekspresi protein Bcl-2 dan cox-2 menggunakan metode imunositokimia. Sebelum sel T47D ditanam, terlebih dahulu dimasukkan
coverslip pada masing-masing sumuran 24-well plate. Sel ditanam dengan kepadatan 5 x 10
5
selsumuran, diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator CO
2
5 lalu dibuang medium. Sel yang telah diinkubasi kemudian ditambahkan sampel uji. Pada
kelompok kontrol, ditambahkan 1000 µL media kultur. Sel kembali diinkubasi selama 24 jam, dibuang larutan uji dan media kultur dibuang. Kemudian dicuci
dengan PBS 2 kali. Sel difiksasi dengan metanol dingin selama 30 menit. Setelah itu, coverslip di masing-masing sumuran diangkat dengan pinset secara hati-hati dan
diletakkan di atas kaca objek lalu dicuci dengan PBS 2 kali, dicuci dengan aquadest lalu keringkan, tambahkan blocking serum, disimpan pada sumur kamar diamkan 15
menit, tambahkan antibodi primer Bcl-2cox-2, diamkan 60 menit, dicuci PBS 2 kali, tambahkan antibodi sekunder Bcl-2cox-2 lalu keringkan, tambahkan larutan label
dan cuci PBS 2 kali selanjutnya dikeringkan, ditambahkan campuran 1:100 DAB substrat. Selanjutnya dicuci dengan aquadest, digenangi dengan hematoxicillin dan
Universitas Sumatera Utara
divisualisasikan dengan reaksi warna. Ekspresi protein Bcl-2 dan cox-2 diamati menggunakan mikroskop cahaya. Sel didiamkan 10 menit. Ditambah etanol absolute
lalu tambahkan xylol dan entelan. Ekspresi protein Bcl-2 dan cox-2 akan memberikan warna coklatgelap, sedangkan yang tidak terekspresi akan memberikan
warna ungu biru. Jumlah sel dihitung pada luasan tertentu, baik yang berwarna
coklatgelap maupun yang berwarna ungubiru Cho, et al., 2009.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
