Tanaman yang Bersifat Antikanker

Terapi pengobatan kanker payudara pada umumnya menggunakan terapi kombinasi ko-kemoterapi dengan obatsenyawa yang memiliki efek sinergis terhadap sel kanker, bersifat spesifik, dan memiliki efek toksik seminimal mungkin. Terapi kombinasi hingga saat ini dikembangkan secara empiris. Namun sampai saat ini belum ada terapi pengobatan untuk kanker payudara yang telah metastasis. Hal tersebut menuntut pengembangan cara pengobatan baru bagi kanker payudara. Pemanfaatan senyawa alam yang non-toksik dengan efektivitas tinggi melawan kanker dapat menjadi pilihan pengembangan terapi kombinasi dengan agen kemoterapi Tyagi, et al., 2004. Oleh karena itu, berbagai metode dapat dilakukan untuk mengembangkan dan mengevaluasi kombinasi terapi yang tepat.

2.4 Tanaman yang Bersifat Antikanker

Salah satu upaya mengatasi penyakit kanker ini adalah mengembangkan obat dari tumbuhan yang mengandung senyawa antikanker. Pengembangan obat kanker dari tanaman ini dipandang memiliki beberapa keuntungan, seperti biaya yang lebih murah, mudah didapat, dan efek samping relatif sedikit Depkes RI, 2008. Beberapa tumbuhan yang telah diteliti memiliki potensi sebagai antikanker dapat dilihat pada Tabel 2.1.

2.4.1 Andaliman

Andaliman Zanthoxylum acanthopodium DC. merupakan salah satu jenis rempah dari tumbuhan liar yang dikenal oleh masyarakat batak, Sumatera Utara. Andaliman termasuk tanaman rempah yang tumbuh di pegunungan kawasan Danau Toba dan sekitarnnya. Diduga penyebaran tanaman secara umum melalui burung yang memakan buah andaliman, kemudian melalui kotoran burung tersebut biji Universitas Sumatera Utara andaliman tersebar kemana-mana dan tumbuh secara liar. Di Sumatera Utara, tanaman ini tumbuh liar pada berbagai tempat, yaitu daerah Angkola, Mandailing, Humbang, Silindung, Dairi, dan Toba Holbung Parhusip, 2006. Tabel 2.1 Beberapa tumbuhan yang berpotensi sebagai antikanker NO Tumbuhan Sel Kanker Bagian yang digunakan Organ Kombinasi dengan Doksorubisin Sumber 1 Keji beling MCF-7 Ekstrak diklorometana sub-fraksi SCD-F9 Payudara A 2 MDA-MB-231 Payudara A 3 PC-3 Prostat A 4 DU-145 Prostat A 5 Daun sambung nyawa WiDr Fraksi etanol dan fraksi etilasetat Usus besar B 6 MCF-7 Payudara B 7 T47D Payudara B 8 Jintan hitam Sel paru Ekstrak klorofrom Paru-paru C 9 MDA-MB-231 Asam linoleat Payudara D 10 Buah lada MDA-MB-231 Ekstrak etanol Payudara E 11 Sambang colok MCF-7 Ekstrak etanol Payudara Memiliki efek sinergis F 12 Biji buah pinang MCF-7 Ekstrak etanol dan fraksi kloroform Payudara Memiliki efek sinergis G 13 Jahe merah Sel hepar Ekstrak etanol Hepar Memiliki efek perlindungan terhadap kerusakan hati H 14 Temulawak H 15 Kunyit H 16 Buah andaliman MCF-7 Ekstrak etilasetat Payudara Memiliki efek sinergis I 17 Daun poguntano MCF-7 Ekstrak n- heksan Payudara Memiliki efek sinergis J 18 T47D Ekstrak etilasetat Payudara Memiliki efek sinergis K 19 Bawang sabrang T47D Ekstrak etilasetat Payudara Memiliki efek sinergis L 20 Kulit batang tanjung T47D Fraksi air Payudara M 21 Daun nimba MDA-MB-231 Ekstrak etanol Payudara N Keterangan: A = Yacoob, et al., 2010 H = Ekowati, et al., 2013 B = Nurulita, et al., 2011 I = Thaib, 2013 C = Rahayu, et al., 2012 J = Lestari, 2013 Universitas Sumatera Utara D = Hasanzadeh, et al., 2011 K = Furqan, 2014 E = Hirokawa, et al. 2006 L = Yanti, 2014 F = Untung, et al., 2008 M = Aulianshah, et al., 2014 G = Meiyanto, et al., 2009 N = Arisanty, 2013 Sistematika tumbuhan andaliman menurut Sharma 1993 sebagai berikut: Divisi : Spermatophyta Sub divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Anak kelas : Dialypetalae Bangsa : Geraniales Suku : Rutaceae Marga : Zanthoxylum Jenis : Zanthoxylum acanthopodium DC. Nama asing andaliman adalah yan-jiao Cina, mouh laaht faa jiu Cina Kanton, mao la hua jiao Cina Mandarin, indonesian lemon pepper Inggris, indonesischer zitronenpfeffer Jerman, tambhul India, sansho Jepang, dan emmayyerma Tibet Anonim, 2012. Andaliman merupakan tumbuhan perdu tegak dengan tinggi 3-8 m, batang dan cabang berwarna kemerahan, beralur, berbulu halus dan berduri. Buah andaliman berbentuk bulat kecil, perikarpnya berwarna hijau tua sampai kemerahan dan warna bijinya hitam, bila digigit mengeluarkan aroma wangi, dan ada rasa getir yang tajam dan khas, serta dapat merangsang produksi air liur. Buahnya termasuk buah sejati berdiameter 3-4 mm yang terdiri dari satu bunga dengan banyak bakal buah yang Universitas Sumatera Utara masing-masing bebas dan kemudian tumbuh menjadi buah tetapi berkumpul pada satu tangkai. Daunnya merupakan daun majemuk dengan panjang 2-25 cm, anak daun 1-6 pasang dengan tangkai yang pendek, tepi daun bergerigi, ujung daun runcing, warna daun hijau dan permukaan atas daun lebih tua dibanding permukaan bawah daun. Panjang bunganya 3 mm. Tumbuhan ini berkembang biak dengan biji. Sistem akar tunggang dimana akar lembaga tumbuh terus menjadi akar pokok yang bercabang-cabang menjadi akar-akar yang lebih kecil dan sedikit berbulu halus di seluruh permukaannya Parhusip, 2006. Buah andaliman mengandung senyawa alkaloid, fenol hidrokuinon, flavonoid, steroidtriterpenoid, tannin, glikosida, dan minyak atsiri Parhusip, 2006. Buah andaliman memiliki aktivitas fisiologi sebagai antioksidan dan antimikroba Wijaya, 2000; Soedarmadji, et al., 2004. Secara tradisional, buah andaliman banyak digunakan sebagai bahan aromatik, tonik, perangsang nafsu makan, obat sakit perut, serta diare. Masyarakat India menggunakan buah andaliman untuk mengobati kelumpuhan dan berbagai macam penyakit kulit, seperti bisul dan kusta. Buah andaliman juga digunakan sebagai bumbu masak di Sumatera Utara, khususnya Tapanuli Utara Suryanto, et al., 2004;

2.4.2 Pengujian sifat antikanker dari berbagai tanaman obat

Hynniewta, et al., 2008; Sirait, dkk., 1991. Pemanfaatan senyawa alam yang non-toksik dengan efektivitas tinggi melawan kanker dapat menjadi pilihan pengembangan terapi kombinasi dengan agen kemoterapi Tyagi, et al., 2004. Oleh karena itu, berbagai metode dapat dilakukan untuk mengembangkan dan mengevaluasi kombinasi terapi yang tepat. Uji efek kombinasi dengan kedua metode tersebut biasanya dilakukan secara in vitro. Metode Universitas Sumatera Utara uji in vitro dapat digunakan sebagai uji praklinik awal untuk menggambarkan interaksi kombinasi, sehingga ketika dilakukan uji in vitro hasilnya akan lebih efisien.

2.4.2.1 Metode pemisahan ekstraksi

Ekstrak aktif dari tanaman yang akan dilakukan penelitian terlebih dahulu dilakukan pemisahan ekstraksi. Metode pemisahan ekstraksi dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu maserasi, perkolasi, reflux, digesti, sokletasi, infundansi, dan dekoktasi. Maserasi adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan pelarut melalui beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan Depkes RI, 1986. Maserasi dapat dilakukan dengan cara memasukkan 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok ke dalam sebuah bejana kemudian dituangi 75 bagian cairan penyari, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil sesekali diaduk. Setelah 5 hari, sari diserkai, ampas diperas dan dicuci dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Sari dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari. Lalu dienaptuangkan dan disaring Depkes RI, 1979. Perkolasi adalah suatu cara penarikan memakai alat yang disebut perkolator dimana simplisia terendam dalam cairan penyari, zat-zat akan terlarut dan larutan tersebut akan menetes secara beraturan Syamsuni, 2006. Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Digesti adalah maserasi kinetik dengan pengadukan secara terus-menerus pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50°C. Universitas Sumatera Utara Sokletasi adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan pelarut yang selalu baru, umumnya dilakukan dengan alat khusus menggunakan alat soklet sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Infundasi adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur pemanasan air bejana infus di atas penangas air mendidih, temperatur terukur 90 – 98°C selama waktu tertentu 15 – 20 menit. Dekoktasi adalah ekstraksi dengan metode infus yang dilakukan selama 30 menit dengan temperatur titik didih air Depkes RI, 2000.

2.4.2.2 Metode pengujian aktivitas antikanker

Pengujian aktivitas antikanker dapat dilakukan dari beberapa parameter, antara lain uji sitotoksik, indeks selektivitas, analisis isobologram, combination index CI, pemacuan apoptosis dan siklus sel dengan metode flow cytometry, dan pengujian ekspresi protein dengan metode imunositokimia. Uji sitotoksik dilakukan secara in vitro untuk menentukan potensi sitotoksik suatu senyawa, seperti obat antikanker. Toksisitas merupakan kejadian kompleks secara in vivo yang menimbulkan kerusakan sel akibat penggunaan obat antikanker yang bersifat sitotoksik. Respon sel terhadap obat sitotoksik dipengaruhi oleh kerapatan sel. Metode MTT [3-4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difenil tetrazolium bromida] adalah salah satu uji sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif. Uji ini berdasarkan pengukuran intensitas warna kolorimetri yang terjadi sebagai hasil metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna. Reaksi warna yang terjadi dapat dilihat pada Gambar 2.3. Pada uji ini digunakan garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase. MTT akan direduksi menjadi formazan oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium, yang termasuk dalam mitokondria dari sel hidup. Universitas Sumatera Utara Formazan merupakan zat berwarna ungu yang tidak larut dalam air sehingga dilarutkan menggunakan HCl 0,04 N dalam isopropanol atau 10 SDS dalam HCl 0,01 N. Intensitas warna ungu terbentuk dapat ditetapkan dengan spektrofotometri dan berkorelasi langsung dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme, sehingga berkorelasi dengan viabilitas sel. Persentase viabilitas dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut Kupcik, et al., 2001. Gambar 2.3 Reduksi MTT menjadi formazan Kupcsik, et al., 2011 absorbansi sampel Viabilitas = x 100 absorbansi kontrol Nilai indeks selektivitas diperoleh dengan menggunakan sel yang berasal dari ginjal monyet hijau afrika sel Vero menggunakan 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5- diphenyltetrazolium bromide MTT. Indeks selektivitas diperoleh dari rasio IC 50 sel Vero sel dibandingkan dengan sel kanker yang diuji. Nilai lebih tinggi dari 3 menunjukkan bahwa obat atau ekstrak memiliki selektivitas yang tinggi Weerapreeyakul, et al., 2012. Indeks selektivitas dihitung menggunakan persamaan di bawah ini: IC 50 sel Vero Indeks selektivitas = IC 50 sel T47D Universitas Sumatera Utara Metode yang umum digunakan untuk mengevaluasi kombinasi obat adalah isobologram dan Combination Index CI. CI= D 1 Dx 1 + D 2 Dx 2 Keterangan: Dx : konsentrasi satu senyawa tunggal yang dibutuhkan untuk memberikan efek sebesar efek kombinasi, yaitu IC50 terhadap pertumbuhan sel kanker payudara D 1 dan D 2 : besarnya konsentrasi kedua senyawa untuk memberikan efek yang sama. Combination Index CI yang diperoleh diinterpretasikan seperti pada Tabel 2.2. Tabel 2.2 Interpretasi nilai CI Combination Index Sumber: Reynolds, et al., 2005 Pengujian siklus sel dan apoptosis menggunakan metode flow cytometry. Flow cytometry adalah teknik yang digunakan untuk menghitung dan menganalisis partikel mikroskopis yang tersuspensi dalam aliran fluida Sayed, et al., 2009. Prinsip dasar dari metode ini adalah berdasarkan fluoresensi. Suspensi sel atau partikel yang hendak dianalisa disedot atau dialirkan. Aliran dikelilingi oleh fluida yang sempit, sel akan melewati satu demi satu melalui sinar laser terfokus. Sinar laser akan menyerang sel tersebut. Sel yang sesuai dengan cahaya laser dan panjang gelombang yang tepat dapat dipancarkan kembali sebagai fluoresensi jika sel mengandung zat alami fluorescent satu atau lebih fluorochrome-label antibodi melekat pada permukaan atau struktur internal sel. Penyerapan cahaya tergantung pada struktur internal sel dan ukuran dan bentuknya. Cahaya fluoresensi terdeteksi CI Interpretasi CI Interpretasi 0,1 sinergis sangat kuat 0,1–0,3 sinergis kuat 0,3–0,7 sinergis 0,7–0,9 sinergis ringan-sedang 0,9–1,1 mendekati additif 1,1–1,45 antagonis ringan-sedang 1,45–3,3 antagonis 3,3 antagonis kuat-sangat kuat Universitas Sumatera Utara oleh serangkaian dioda. Filter optik berfungsi untuk memblokir cahaya yang tidak diinginkan. Hasil data disimpan melalui komputer Ulfah, 2010. Flow cytometry dapat digunakan untuk menganalisa DNA content sel melalui pewarnaan sel dengan pewarna propidium iodide PI atau 4’,6’-diamino-2-phenylindole DAPI. Dengan adanya fluorochrome yang memiliki kemampuan berinterkalasi dengan basa untai DNA seperti propidium iodide, maka tiap sel yang memiliki jumlah set kromosom yang berbeda akan memberikan intensitas fluoresensi yang berbeda. Semakin banyak set kromosom maka intensitas fluoresensi akan semakin besar. Untuk pengujian apoptosis, ditambahkan antibodi Annexin V dan propidium iodida, sedangkan pengujian siklus sel ditambahkan antibodi propidium iodida. Lalu diukur dengan alat flow cytometer Hostanska, et al., 2004. Flow cytometer atau FACS Fluorescence Activated Cell Sorting digunakan untuk membaca intensitas fluoresensi tiap sel Givan, 2001. Skema alat flow cytometer ditunjukkan oleh Gambar 2.4. Gambar 2.4 Skema alat flow cytometer Pewarnaan Sel kultur Sel yang telah disuspensikan Penambahan antibodi Laser Sel dihomogenkan Penetapan Ampas Layar monitor komputer Universitas Sumatera Utara Imunositokimia merupakan suatu metode yang digunakan untuk mendeteksi adanya ekspresi suatu protein spesifik atau antigen dalam sel dengan menggunakan antibodi spesifik yang akan berikatan dengan protein atau antigen. Ada dua jenis metode imunositokimia, yaitu metode langsung dan metode tidak langsung. Pada metode langsung, antibodi yang mengikat fluoresen atau zat warna langsung berikatan dengan antigen pada sel. Sedangkan pada metode tidak langsung, antigen diikatkan pada antibodi primer secara langsung kemudian ditambahkan antibodi sekunder yang mengikat enzim seperti peroksidase, alkali fosfatase, atau glukosa oksidase. Antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer. Selanjutnya ditambahkan substrat kromogen yang akan diubah oleh enzim sehingga terjadi pembentukan warna pigmen yang akan mewarnai sel. Untuk menjamin antibodi agar dapat mengikat antigen, sel harus difiksasi dengan ditempelkan pada bahan pendukung padat sehingga antigen akan immobile. Hal ini dapat dilakukan dengan cara menumbuhkan sel pada slide mikroskop, coverslip, atau bahan pendukung plastik yang sesuai. Ada dua macam metode fiksasi, yaitu pelarut organik dan reagen cross-linking. Pelarut organik seperti alkohol dan aseton akan memindahkan lipid, mendehidrasi sel, dan mengendapkan protein. Reagen cross-linking seperti paraformaldehid membentuk jembatan intermolekuler melalui gugus amino bebas. Imunositokimia melibatkan inkubasi sel dengan antibodi. Antibodi akan berikatan dengan antigen atau protein spesifik di dalam sel. Antibodi yang tidak berikatan dipisahkan dengan pencucian, sedangkan antibodi yang berikatan dideteksi secara langsung dengan antibodi primer berlabel dan secara tidak langsung dengan antibodi sekuder berlabel enzim atau fluoresen. Interpretasi data ekspresi protein tertentu akan ditunjukkan dengan warna coklat pada Universitas Sumatera Utara sitoplasma bukan inti sel. Warna biru pada sitoplasma menunjukkan tidak adanya ekspresi pada sel atau level ekspresi yang rendah sehingga tidak terdeteksi Anonim, 2010. Keuntungan metode imunositokimia ini adalah hasil pemeriksaan cepat didapat 24 jam, mudah, relatif murah, dan dapat digunakan untuk pemeriksaan sampel dalam jumlah banyak Abbas, et al., 2003; Stites, et al., 1997. Universitas Sumatera Utara

BAB III METODE PENELITIAN