Cara pembuatan: Sebanyak 1 sachet M199 sachet, 2,2 gram NaHCO
3
, 2 gram Hepes dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer. Ditambahkan 800 mL aquabidest steril dan
dihomogenkan menggunakan stirer magnet. Diatur pH 7,2 – 7,4 dengan menggunakan pH meter. Penyesuaikan pH dilakukan dengan menambahkan HCL 1
N bila larutan basa atau NaOH 1 N bila larutan asam. Ditambahkan aquabidest hingga volume 1 L dan dilakukan sterilisasi dengan filter vaccum di dalam LAF
Laminar Air Flow. Dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril. Lakukan proses penyaringan dengan menggunakan filter, aliquot media ditampung
dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire date, nama pembuat. Media disimpan pada suhu 2 – 8
o
C Handayani, et al., 2001.
3.8.4 Pembuatan media MK-M199
Komposisi : Foetal Bovine Serum FBS 10 Penisilin-streptomisin
3 Fungison
1 M199
ad 100 mL Cara pembuatan: Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF
Laminar Air Flow, beri identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire date, dan nama pembuat, simpan pada suhu 2 – 8
o
C Handayani, et al., 2001.
3.9 Penumbuhan Sel
3.9.1 Penumbuhan sel kanker payudara T47D
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 mL media RPMI pada tabung konikel 15 mL, ambil ampul sel T47D dari freezer -80
o
C atau tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, ambil suspensi sel dalam ampul,
masukkan tetes demi tetes kedalam media RPMI yang telah disiapkan, sentrifuge
Universitas Sumatera Utara
pada 600 rpm selama 5 menit, buang supernatan dan tambahkan 4 mL MK-RPMI dan resuspensi hingga homogen. Transfer masing-masing 2 mL ke dalam flask kultur
baru. Tambahkan 5 mL MK-RPMI ke dalam masing-masing flask kultur, dan homogenkan. Amati kondisi sel dengan menggunakan inverted microscope. Pastikan
sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur tidak menggerombol pada bagian tertentu. Beri identitas pada flask kultur, kemudian simpan dalam inkubator CO
2
Doyle, et al., 2000
.
3.9.2 Subkultur sel kanker payudara T47D
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, lakukan pengerjaan pada LAF. Proses panen sel T47D dilakukan dengan cara mengambil 500 µL
panenan sel dan masukkan ke dalam flask kultur. Tambahkan 6 mL MK-RPMI, homogenkan. Inkubasi sel pada inkubator CO
2
, amati kondisi sel pada keesokan harinya Doyle, et al.,
2000 .
3.9.3 Panen sel kanker payudara T47D
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, amati kondisi sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluen, semua pekerjaan
dilakukan pada LAF. Buang MK dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, cuci sel 2 kali dengan 5 mL PBS Phosphate Buffer Salin, tambahkan 400 µL
Tripsin-EDTA 0,25 secara merata, kemudian inkubasi di dalam inkubator CO
2
selama ± 5 menit, dan tambahkan 4 mL MK untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan mikropipet agar sel terlepas satu-satu tidak menggerombol.
Amati keadaan sel di inverted microscope. Resuspensi sel kembali jika masih ada sel yang menggerombol. Transfer sel ke dalam tabung konikel Doyle, et al.,
2000.
Universitas Sumatera Utara
3.9.4 Penumbuhan sel Vero
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 mL media M199 pada tabung konikel, ambil ampul dari freezer -80
o
C sel Vero atau tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, ambil suspensi sel dalam ampul, masukkan
tetes demi tetes ke dalam media M199 yang telah disiapkan, sentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, buang supernatan dan tambahkan 4 mL MK-M199 dan resuspensi
hingga homogen. Transfer masing-masing 2 mL ke dalam flask kultur baru. Tambahkan 5 mL MK-M199 ke dalam masing-masing flask kultur, dan
homogenkan. Amati kondisi sel dengan menggunakan inverted microscope. Pastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur tidak menggerombol pada bagian
tertentu. Beri identitas pada flask kultur, kemudian simpan dalam inkubator CO
2
Handayani, et al., 2001.
3.9.5 Subkultur sel Vero
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, lakukan pengerjaan pada LAF. Lakukan proses panen sel Vero dengan cara mengambil 500 µL panenan
sel Vero dan masukkan ke dalam flask kultur. Tambahkan 6 mL MK-M199, homogenkan. Inkubasi sel pada inkubator CO
2
, amati kondisi sel pada keesokan harinya Handayani, et al., 2001.
3.9.6 Panen sel Vero
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, amati kondisi sel Vero. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada LAF. Buang MK-RPMI sel T47D dan MK-M199 sel Vero dari masing-masing flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, cuci sel 2 kali
dengan 5 mL PBS Phosphate Buffer Saline, tambahkan 400 µL Tripsin-EDTA
Universitas Sumatera Utara
0,25 secara merata, kemudian inkubasi di dalam inkubator CO
2
selama ± 5 menit, dan tambahkan 4 mL MK untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan
mikropipet agar sel terlepas satu-satu tidak menggerombol. Amati keadaan sel di inverted microscope. Resuspensi sel kembali jika masih ada sel yang menggerombol.
Transfer sel ke dalam tabung konikel Handayani, et al., 2001.
3.9.7 Penghitungan sel T47D dan sel Vero
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 µL panenan sel dan pipetkan ke dalam hemositometer. Hitung jumlah sel di bawah
mikroskop dengan menggunakan counter. Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung A, B, C, dan D, setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak Gambar 3.1.
Gambar 3.1 Hemositometer
Hitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang gelap mati dan sel yang berada di batas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel di batas kanan dan bawah
ikut dihitung. Hitung jumlah sel per mL dengan rumus:
4
10 4
x selD
selC selB
selA ml
sel
∑ ∑
∑ ∑
∑
+ +
+ =
Hitung jumlah total sel yang diperlukan. Misalnya untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate, maka jumlah total sel yang diperlukan adalah 1x10
4
sumuran x 100 sumuran dibuat lebih = 1x10
6
sel Hitung volume panenan sel yang diperlukan dalam mL dengan rumus:
Universitas Sumatera Utara
Jumlah total sel yang diperlukan Volume panenan sel =
Jumlah sel terhitung mL Ambil volume panenan sel, transfer ke tabung konikel baru kemudian tambahkan
MK sampai total volume yang diperlukan CCRC, 2009.
3.10 Pembuatan Larutan Uji
