III. BAHAN DAN METODE
A. WAKTU DAN TEMPAT
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai Maret 2009, bertempat di laboratorium mikrobiologi Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional
PPOMN Badan POM RI, jalan percetakan negara no. 23 Jakarta.
B. BAHAN DAN ALAT
Bahan penelitian adalah daging ayamyang diambil dari salah satu supermarket di Jakarta, bakteri Campylobacter jejuni ATCC 33291; media yang
digunakan adalah Bolton broth + sterile lysed defibrined horse blood + antibiotic solution
Merck, modified charcoal cefoperazone deoxycholate agar mCCDA dan suplemen Merck, Preston agar, growth factor suplement FPB, dan Preston
selektif suplemen Oxoid, Brucella broth racikan, columbia blood agar Oxoid, triple sugar iron
III agar TSIA Oxoid, Muller Hinton blood agar Oxoid, braint heart infusion broth
BHIB Merck, buffered peptone water BPW Merck dan pereaksi yang digunakan adalah pereaksi oksidase Oxoid, larutan H
2
O
2
3 Oxoid, sodium hipurat Remmel, larutan ninhidrin racikan, cakram asam
nalidiksat Oxoid, cakram cefaalotin Oxoid, indoxyl acetat discs Remmel, mikrobank Protect, dan pereaksi anaerocult C Merck. Sedangkan peralatan yang
digunakan adalah inkubator 25 + 1 C Sanyo, incubator 37 + 1
C dan 41,5 + 1 C
Memmert , penangas air 37 + 1 C Memmert, bejana anaerob BBLOxoid,
neraca ohaus Sartorius, laminar air flow Esco, colony counter Ecolyte, mikroskop Nikon, stomacher Seward, autoclave Hirayama, oven Memmert,
coolbox, lemari pendingin Toshiba dan peralatan gelas.
C. METODE PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen laboratorium. Penelitian ini terdiri dari 4 tahap, yaitu 1 persiapan kultur uji yang terdiri atas a konfirmasi
kemurnian bakteri Campylobacter jejuni pada kultur murni dan b analisa jumlah koloni Campylobacter jejuni; 2 penetapan Campylobacter jejuni sebagai inokulum;
3 persiapan sampel uji; dan 4 isolasi Campylobacter jejuni pada daging ayam.
Pada penelitian ini digunakan tiga perlakuan dan 10 ulangan untuk masing- masing sampel. Perlakuan pertama yaitu sampel negatif daging ayam yang tidak
diinokulasi dengan Campylobacter jejuni, perlakuan kedua yaitu sampel positif daging ayam yang diinokulasi dengan Campylobacter jejuni dan perlakuan ketiga
yaitu kontrol positif inokulum Campylobacter jejuni. Disain penelitian dan alur proses dapat dilihat pada Tabel 5 dan Gambar 2.
Tabel 5 Disain penelitian
Perlakuan Ulangan Sampel Kode 1 2 3 4 5 6 7 8
9 10
Sampel Negatif
A A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9
A10 Sampel
Postif B
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10
Kontrol Positif
C C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9
C10
Gambar 2 Diagram alir penanganan sampel dan bakteri uji. Pada sampel negatif kehadiran atau ketidakhadiran bakteri Campylobacter
jejuni pada saat analisa tidak mempengaruhi hasil validasi sekunderverifikasi.
Dengan demikian pada sampel negatif, hasil yang diperoleh boleh positif dan boleh juga negatif. Jika hasil analisa menunjukkan adanya bakteri Campylobacter jejuni,
menunjukkan bahwa daging ayam tersebut terkontaminasi bakteri tersebut. Sampel daging
ayam
25 gram + 225 ml Bolton broth
25 gram + 225 ml Bolton broth + 2,5 ml inokulum
Analisis sampel positif
2,5 ml inokulum + 250 ml Bolton broth
Analisis kontrol positif
Analisis sampel negatif
Inokulum Campylobacter jejuni
Sebaliknya jika dalam analisa bakteri Campylobacter jejuni tidak teridentifikasi, menunjukkan bahwa daging ayam tersebut tidak terkontaminasi.
Pada sampel positif kehadiran dan ketidakhadiran bakteri Campylobacter jejuni
pada saat analisa sangat mempengaruhi hasil validasi sekunderverifikasi. Kehadiran bakteri Campylobacter jejuni pada saat analisa bisa merupakan perolehan
kembali recovery dari hasil inokulasi dengan sengaja dan juga dapat merupakan kontaminasi awal. Hal itu dilakukan untuk melihat kemampuan metode analisa untuk
mengisolasi kembali bakteri Campylobacter jejuni. Berdasarkan AOAC 1999 80 perolehan kembali recovery dari sampel positif merupakan nilai yang ideal dari
hasil validasi, tetapi perolehan kembali recovery berkisar antara 50 - 95 dianggap cukup meyakinkan.
Pada kontrol positif kehadiran atau ketidakhadiran bakteri Campylobacter jejuni
pada saat analisa sangat mempengaruhi hasil validasi sekunderverifikasi. Kehadiran bakteri Campylobacter jejuni pada saat analisa benar-benar diharapkan
dan menghasilkan perolehan kembali recovery sebesar 100. Campylobacter jejuni bersifat obligat mikroaerofilik optimum pada 5 O2,
10 CO
2
dan 85 N
2
. Untuk mencapai pertumbuhan yang optimal, kondisi pengeraman inkubasi diatur sedemikian rupa sehingga kondisi atmosfer dapat
diperoleh pada konsentrasi yang dikehendaki. Dalam penelitian ini, pengondisian mikroaerofilik dilakukan dengan anerobic jar menggunakan anaerocult C sebagai
pengatur gas. Merck 2003 menjelaskan bahwa anaerocult C diaplikasikan untuk
mengurangi kadar oksigen dan memperkaya karbondioksida di dalam anaerobik jar untuk melakukan kultur terhadap Campylobacter spesies dan mikroorganisme lain
dengan persyaratan ketat untuk pertumbuhannya seperti Neisseria sp, Capnicytophaga sp, Eikenella corrodens, Haemophillus sp
. Konsentrasi atmosfer di dalam jar yang dihasilkan 8 – 10 CO
2
dan 5 – 7 O
2
. Anaerocult C diformulasikan kedalam satu kemasan dari bahan-bahan kimia seperti kieselguhr, serbuk besi,
natrium karbonat dan asam sitrat. Adapun prinsip kerjanya yaitu dengan penambahan 6 ml air akan menentukan jumlah oksigen yang didsitribusikan dari
serbuk besi, pada saat yang sama CO
2
terbentuk dari natrium karbonat Merck
2003.
D. PROSEDUR VALIDASI SEKUNDER