mempengaruhi dinding sel, 2 mengganggu fungsi membran sel, 3 menghambat sintesis protein, dan 4 menghambat sintesis asam nukleat.
d. Uji hidrolisis hipurat Tes ini dimaksudkan untuk mengidentifikasi aktivitas enzim
hippurate hydralase dari bakteri grup Streptococci, Campylobacter jejuni, Gardnerella vulgaris
dan mikroorganisme lain. Tes ini didasarkan pada hidrolisis substrat sodium hipurat oleh enzim hippurate hydralase dengan
memproduksi asam benzoat dan glisin. Glisin diproduksi dari reaksi enzimatik dan dengan penambahan khromogen ninhidrin akam
menghasilkan substrat berwarna biru sampai violet Sigma 2008. e. Uji hidrolisis indoksil asetat
Uji ini dimaksudkan untuk mengidentifikasi aktivitas enzim esterase pada kelompok bakteri Campylobacter spesies, Wolinella spesies dan
Helicobacter spesies . Enzim esterase akan menghasilkan indoksil secara
spontan dari indoksil asetat dengan indikator adanya perubahan warna menjadi biru dengan adanya oksigen.
F. VALIDASI METODE ANALISA
Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang obyektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi. Validasi
metode adalah suatu proses untuk mengonfirmasi bahwa suatu metode mempunyai unjuk kerja yang konsisten, sesuai dengan apa yang dikehendaki dalam penerapan
metode tersebut. Laboratorium harus memvalidasi metode analisa jika: 1 metode tidak baku, 2 metode yang dikembangkan oleh laboratorium, 3 metode baku yang
digunakan diluar lingkup yang dimaksudkan dan 4 metode baku yang dimodifikasi. Laboratorium juga harus merekam hasil yang diperoleh, prosedur yang digunakan
untuk validasi dan pernyataan bahwa metode tersebut tepat untuk penggunaan yang dimaksud ISOIEC 17025 – 2005 dalam Udin 2007.
Sac 2002 menjelaskan bahwa karakteristik kinerja performance characteristics
yang harus diperhatikan dalam melakukan validasi metode secara lengkap full validation meliputi 9 parameter, yaitu 1 akurasi, 2 presisi, 3
sensitivitas, 4 spesifisitas, 5 penetapan batas terendah dari kisaran hitung limit deteksi, 6 limit kuantitasi, 7 ketahanan, 8 kekasaran, dan 9 linearitas.
Akurasi adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur suatu nilai yang aktual atau sebenarnya dari suatu analit, misalnya mikroba target. Apabila suatu
analit mikroba target secara alami ada di dalam suatu sampel atau di-spike ke dalam sampel sebagai bagian dari suatu tantangan atau uji profisiensi, metode
tersebut harus mampu mendeteksi atau memunculkan kembali recover analit atau mikroorganisme tersebut pada konsentrasi yang benar atau frekuensinya mendekati
akurat. Presisi adalah tingkat kesamaan degree of agreement antar hasil uji
individual ketika metode tersebut diterapkan secara berulang sampai dengan penggandaan sampling dari suatu sampel homogenat. Presisi dari suatu metode
analisis biasanya ditunjukkan dengan simpangan baku relatif relative standard deviation
atau coefficient of variation dari suatu seri pengukuran. Presisi dapat diukur dari tingkat repitabilitas atau tingkat reproduksibilitas dari metode analisa
yang dilakukan dalam kondisi normal. Repitabilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji
yang identik dalam laboratorium yang sama oleh operator analis yang sama dengan menggunakan peralatan yang sama dalam interval waktu singkat. Sedangkan
Reproduksibilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam
laboratorium yang berbeda dan peralatan berbeda, atau dengan analis dan peralatan berbeda di dalam laboratorium yang sama.
Sensitifitas adalah kemampuan metoda untuk mendeteksimengukur mikroorganisme target dalam jumlah sekecil mungkin.
Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksimengukur mikroorganisme tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya mikroorganisme
asingbahanmatrik lain. Penetapan batas terendah dari kisaran hitung limit deteksi adalah
konsentrasi terendah dari mikroorganisme dalam contoh yang dapat terdeteksi, akan tetapi tidak perlu terkuantisasi, dibawah kondisi pengujian yang disepakati.
Limit kuantitasi adalah biasa juga disebut sebagai limit pelaporan adalah konsentrasi terendah dari mikroorganisme yang dapat ditentukan dengan tingkat
presisi dan akurasi yang dapat diterima, dibawah kondisi pengujian yang disepakati. Ketahanan adalah suatu ukuran dari kapasitasnya terhadap sisa yang tidak
dipengaruhi oleh sedikit tetapi variasi-variasi yang disengaja dalam parameter- parameter metode dan memberikan suatu indikasi dari reliablilitasnya selama
penggunaan normal.
Kekasaran adalah kemampuan untuk memberikan hasil uji yang sama pada
contoh yang sama, tetapi keragaman kondisi pengujian berbeda. Bertujuan untuk mengetahui pengaruh faktor eksternal terhadap metode contoh dan metode sama,
tetapi laboratorium, alat, analis dan waktu pengujian berbeda. Linearitas adalah kemampuan metode analisa yang menunjukkan bahwa
larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analit yang proposional dengan konsentrasi, secara langsung atau melalui transformasi
matematika. Jenis parameter yang harus dilakukan pada validasi primer, baik secara
kualitatif maupun kuantitatif secara ringkas dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Parameter validasi primer untuk uji mikrobiologi
Parameter Uji Kualitatif
Uji Kuantitatif Akurasi Tidak
Ya Presisi Tidak
Ya Spesifisitas Ya
Ya Limit Deteksi
Ya Ya
Limit Kuantisasi Tidak
Ya Linearitas Tidak
Ya Kisaran Hitung
Tidak Ya
Ketahanan Ya
Ya Repeatabilitas Ya
Ya Kekasaran Ya
Ya
Sumber: USP 2007
Dalam validasi primer, semua biakan positif tersangka dan negatif tersangka harus diverifikasi. Validasi harus meliputi sampel alami yang dipelajari sepanjang
waktu Sac 2002. Validasi sekunder atau verifikasi adalah proses konfirmasi kembali untuk
menunjukkan metode sesuai dalam memenuhi kebutuhan laboratorium. Validasi sekunder diperlukan karena adanya perbedaan kondisi antara saat metode tersebut
dibuat dengan metode tersebut diadopsi oleh suatu laboratorium. Kondisi yang dapat mempengaruhi penggunaan metode analisa antara lain perbedaan 1 kondisi
lingkungan, 2 personil, 3 instrumen, dan 4 media dan pereaksi yang dipakai dalam metode baku atau metode resmi dengan laboratorium yang akan
menggunakannya Sukarno 2005. Kondisi lingkungan sangat mempengaruhi hasil pengujian, seperti suhu,
kelembaban, cahaya, oksigen dan akses terhadap ruang pengujian. Kondisi tersebut dapat menyebabkan terjadinya kontaminasi silang, menyebabkan perubahan media
dan dapat mempengaruhi ketahanan mikroba. Dengan demikian faktor lingkungan harus dijaga secara ketat untuk memperoleh kondisi optimal. Pengaturan kondisi
lingkungan sangat bervariasi antara laboratorium baik laboratorium lokal maupun internasional. Adanya variasi tersebut mengharuskan laboratorium yang akan
mengadopsi suatu metode analisa melakukan validasi sekunder terhadap metode analisa tersebut.
Personil penguji sangat mempengaruhi hasil pengujian, sehingga diperlukan kemampuan dan pengalaman yang memadai. Pelatihan terstruktur
diperlukan untuk meningkatkan pengetahuan dan ketrampilan personil dan merupakan hal mutlak yang harus dilakukan oleh suatu organisasi. Kemampuan dan
ketrampilan penguji pada saat melakukan validasi primer metode analisa berbeda dengan personil yang akan mengadopsi metoda analisa tersebut. Validasi sekunder
diperlukan untuk mengonfirmasi kemampuan dan ketrampilan personil. Instrumen merupakan suatu sarana yang diperlukan dalam menganalisis
mikroba. Instrumen yang diperlukan harus memiliki spesifikasi khusus dan dipelihara secara periodik. Kalibrasi dan monitoring secara teratur dapat menjamin
mutu hasil pengujian. Penggunaan instrumen yang tidak benar dapat memberikan hasil yang tidak valid, sehingga validasi sekunder diperlukan untuk mengonfirmasi
kinerja instrumen. Karakteristik spesifik dari mikroba dapat diamati menggunakan media dan
pereaksi. Spesifikasi dan penanganan media harus benar-benar diperhatikan dalam menganalisa mikroba target. Ada beberapa media dan pereaksi yang meskipun
memiliki komposisi yang sama tetapi dapat memberikan hasil yang berbeda.
Validasi sekunder harus dilakukan untuk mengonfirmasi penggunaan media dan pereaksi sehingga mutu hasil pengujian dapat dipertanggungjawabkan.
Tujuan validasi sekunder adalah untuk memastikan, bahwa laboratoriumpersonel penguji dapat menerapkan metode tersebut dengan baik
ketersediaan peralatan, fasilitas pereaksi, penguji, ketrampilan, dan kompetensi. Selain itu validasi sekunder juga bertujuan untuk menjamin mutu hasil pengujian.
Dalam melakukan validasi sekunder, terdapat beberapa parameter yang harus diukur, yaitu jika pengujian bersifat kuantitatif maka parameter yang harus diukur
adalah presisi dan akurasi sedangkan jika pengujian bersifat kualitatif maka parameter yang harus diukur adalah spesifisitas USP 2007, seperti pada Tabel 4.
Tabel 4 Paramater validasi sekunder untuk uji mikrobiologi Parameter
Uji Kualitatif Uji Kuantitatif
Akurasi Tidak Ya
Presisi Tidak Ya
Spesifisitas Ya Tidak
Limit Deteksi Tidak
Tidak Limit Kuantisasi
Tidak Tidak
Linearitas Tidak Tidak
Kisaran Hitung Tidak
Tidak Ketahanan Tidak
Tidak Repeatabilitas Tidak
Tidak Kekasaran Tidak
Tidak
Sumber: USP 2007
Untuk menganalisa hasil verifikasi maupun validasi, data presisi dapat dievaluasi menggunakan persen standar deviasi relatif RSD. Suatu metode analisa
dapat diadopsi dalam suatu laboratorium jika nilai RSD berkisar 5. Akurasi biasanya dinyatakan sebagai persen recovery. Kriteria kecermatan
sangat tergantung kepada konsentrasi mikroorganisme dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode RSD. Suatu metode analisa dapat diadopsi jika hasil
verifikasi memperoleh nilai recovery sebesar 90 – 110. Spesifisitas dapat dihitung menggunakan jumlah sampel positif yang
menunjukkan hasil pengujian positif dibagi dengan hasil pengujian positif terhadap kontrol positif dikalikan 100. Hasil penghitungan menunjukkan nilai recovery dari
hasil validasiverifikasi metode analisa USP 2007. Idealnya, nilai recovery adalah sebesar 80 tetapi metode analisa dianggap valid jika nilai recovery berkisar 50 -
95 AOAC 1999.
Untuk deteksi patogen, metode yang digunakan harus divalidasi sehingga mampu mendeteksi jumlah terendah dari organisme yang ditetapkan oleh metode
baku tersebut. Apabila pedoman tersebut tidak ada di dalam metode baku sebagai pedoman umum, jumlah organisme yang digunakan sebagai inokulum dalam uji
validasi untuk patogen dalam sampel yang diuji antara 10 – 100 koloni. Hasil positif untuk masing-masing mikroorganisme harus diperoleh. Strain mikroorganisme
acuan yang digunakan harus tepat untuk ditetapkan dalam publikasi akhir dari baku yang relevan seperti metode baku APHA untuk pengujian air dan air limbah, British
pharmacopeia, Europian pharmacopeia dan metode baku AOAC Sac 2002. Selain
itu, mikroorganisme yang digunakan sebagai baku dapat menggunakan produk komersial dengan sertifikat ATCC atau NCTC.
G. VALIDASI METODE ANALISA DAN PENERAPANNYA Metode pengujian, terutama yang diterapkan oleh laboratorium yang telah
diakreditasi harus dikarakterisasi dengan benar untuk menetapkan dengan jelas bidang penerapannya dan kehandalan mutlak yang diberikannya. Inilah maksud
utama dari validasi. Karena itu, karakteristik unjuk kerja yang paling penting, misalnya batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi, presisi, reproduksibilitas, dan
kekasaranruggednes harus ditetapkan dibawah kondisi yang realistik, yaitu personel penguji yang menggunakan metode dalam pekerjaan rutin, juga harus
menetapkan karakteristik ini dalam matriks asli Siregar 2008. Dalam praktik, pekerjaan pengujiananalisis digunakan untuk memberi solusi
pada banyak masalah yang beragam yang timbul dalam ilmu dan tekhnologi. Sesuai dengan itu, kriteria yang sangat berbeda harus diterapkan jika mengases metode
pengujian individu untuk mempertimbangkan kesesuaian dalam kasus tertentu. Validasi suatu metode harus menjelaskan sebelumnya untuk apa metode itu sesuai
dan untuk apa tidak sesuai. Keterbatasan penerapan metode sedapat mungkin harus ditetapkan dengan seksama agar personel penguji dapat mengambil cara lain untuk
memperoleh data yang handal untuk mengarakterisasi suatu metode atau dengan jelas memahami apakah metode ini suatu masalah yang konkrit, masih perlu
dilakukan karakterisasi Siregar 2008.
Validasi suatu metode pengujian membantu memberikan definisi yang jelas dari konsep mutu modern, untuk membuktikan dalam suatu cara yang transparan
didalam laboratorium itu sendiri dan juga untuk kontraktor. Validasi harus dianggap, disatu pihak sebagai penyelesaian dari suatu pengembangan metode, dan dilain pihak
sebagai bukti dari keahlian jika mengadopsi suatu metode yang dikembangkan secara eksternal. Karena itu, validasi selalu perlu, tanpa memperhatikan metode baku
nasional atau internasional berkaitan dengan yang diterapkan. Juga validasi adalah suatu proses berkelanjutan dan dengan tegas dinyatakan bahwa setiap modifikasi
dari sistem analitik laboratorium berbeda, peralatan uji berbeda, penguji berbeda, dan lain-lain diharuskan melakukan validasi ulang perlu disesuaikan dengan jenis
dan lingkup modifikasi Siregar 2008. Dalam beberapa hal, validasi dan dokumentasinya selain persyaratan resmi
akreditasi, juga menunjukan kompetensi suatu laboratorium. Hal ini sangat penting, karena pengalaman menunjukan, peralatan analitik, instrumentasi analisis tidak
memberikan bukti seberapa mampu cakap suatu laboratorium. Jenis, luas, dan pelaksanaan validasi yang benar memungkinkan mengambil kesimpulan tidak saja
pada keberadaan peralatan instrumental yang memadai, tetapi juga menunjukan bahwa laboratorium memiliki suatu manajemen termotivasi dan personel yang
kompeten, terutama nilai pelayanan costumer terhadap suatu laboratorium menjadi nyata melalui tingkat tujuan mutu pengujian, dioreintasikan pada kebutuhan nyata
costumer yang memerlukan data analitikpengujian Siregar 2008.
Validasi metode pengujian adalah proses yang menetapkan dan mengevaluasi sifat atau gambaran dari manfaat, ini merupakan suatu bagian dari program jaminan
mutu. Banyak metode divalidasi dengan konsensus organisasi standar. Beberapa metode wajib digunakan karena merupakan standar resmi tanpa memperhatikan cara
atau apakah metode tersebut telah divalidasi. Sebagai suatu aturan umum, metode resmi dan metode standar yang diterapkan pada jenis sampel yang telah ditetapkan,
dan metode yang telah diuji secara kolaboratif pada matriks dan konsentrasi minat, tidak perlu divalidasi sebelum digunakan. Disatu pihak, penggunaan metode tersebut
tidak selalu memastikan hasil yang diinginkan. Seorang personel penguji yang telah memiliki beberapa pengalaman dalam penggunaan metode akan mempunyai
kesempatan yang meningkat secara signifikan dalam pengujian yang memuaskan,
tetapi juga penting diingat bahwa suatu metode yang absah dalam situasi yang lain. Karena itu, jika personel penguji tidak berpengalaman dengan metode atau situasi
pengujian yang tidak biasa, validasi ulang adalah jalan yang lebih aman Siregar
2008.
III. BAHAN DAN METODE
A. WAKTU DAN TEMPAT
