ANALISIS DATA VALIDASI SEKUNDER

E. ANALISIS DATA VALIDASI SEKUNDER

Untuk mengetahui kemurnian Campylobacter jejuni, data hasil pengujian konfirmasi dibandingkan dengan karakteristik spesifik pada metode analisa. Untuk mengetahui besarnya perolehan kembali Recovery dalam validasi sekunderverifikasi, maka data hasil analisis dapat dihitung sebagai berikut: Jumlah hasil positif pada sampel positif x 100 Jumlah hasil positif pada kontrol positif Metode analisa resmi dapat diadopsi untuk keperluan laboratorium jika hasil validasi sekunderverifikasi pada sampel positif dan kontrol positif menunjukkan tingkat recovery 50. Jika hasil analisa dalam validasi sekunderverifikasi menunjukkan tingkat recovery 50 maka metode analisa tersebut dinyatakan valid sehingga bisa diterapkan dalam pengujian. Jika hasil analisa dalam validasi sekunderverifikasi menunjukkan tingkat recovery 50 maka metode analisa tersebut dinyatakan tidak valid sehingga tidak bisa diterapkan dalam pengujia IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. PERSIAPAN KULTUR UJI 1. Konfirmasi kemurnian kultur Campylobacter jejuni Konfirmasi kemurnian Campylobacter jejuni dilakukan dengan metode analisa yang akan diadopsi yaitu ISO 10272 2006 bagian 1. Karakteristik pertumbuhan isolat Campylobacter jejuni pada berbagai media dan kondisi pengujian dapat dilihat pada Tabel 8. Tabel 8 Pengamatan Campylobacter jejuni pada uji kemurnian Hasil Konfirmasi Media Pengamatan Reaksi Gambar BHIB Keruh + Bolton broth Keruh + mCCDA Bentuk datar, melebar, tidak beraturan, warna keabu-abuan dan sedikit berlendir + Preston agar Bentuk datar, berwarna ke abu- abuan sampai coklat, sedikit basah, ukuran koloni berbeda + Morfologi dan motilitas Gram negatif, bentuk spiral, motil dengan corlscrew + Pertumbuhan 25 C mikroaerofilik Tidak ada pertumbuhan - Pertumbuhan 41,5 C aerobik Tidak ada pertumbuhan - Oksidase Terbentuk warna biru pada stick + Media Hasil Konfirmasi Pengamatan Reaksi Gambar TSIA Tidak terjadi perubahan warna media - Katalase Terbentuk gelembung gas + Asam Nalidiksat Terbentuk zona bening pada dan sekitar cakram + Cefalotin Tidak ada zona bening di sekitar cakram - Hidrolisis Hipurat Perubahan warna menjadi ungu tua + Hidrolisis Indoksil Acetat Terbentuk warna biru tua pada stick + Kesimpulan Terkonfirmasi kemurnian Campylobacter jejuni Keterangan : + : reaksi positif ; - : reaksi negatif Berdasarkan Tabel 8 dapat diketahui bahwa Campylobacter jejuni dari master kultur stok acuan dengan sertifikat ATCC 33291 merupakan kultur murni. Hal itu dibuktikan dengan kesesuaian karakterisitik spesifik yang ditunjukkan pada media dan pereaksi yang digunakan serta kondisi mikroaerofilik yang diterapkan dalam pengujian konfirmasi dengan metode analisa yang digunakan. Dengan demikian bakteri Campylobacter jejuni, media dan pereaksi serta pengondisian mikroaerofilik tersebut dapat diadopsi dalam penelitian tahap 4. Dalam melakukan konfirmasi kemurnian Campylobacter jejuni , Bolton broth dan BHIB digunakan sebagai media pengaya. Bolton broth merupakan media khusus yang diformulasikan untuk memulihkan kondisi dan pertumbuhan Campylobacter jejuni. Sedangkan BHIB merupakan media yang digunakan untuk memulihkan kondisi dan pertumbuhan bakteri secara umum. Media selektif untuk isolasi dalam penelitian ini menggunakan mCCDA dan Preston agar. Pertumbuhan Campylobacter jejuni pada kedua media selektif dipengaruhi oleh proses pengayaan. Apabila inkubasi pada media BHIB dilakukan pada suhu 41,5 C selama 24 jam secara mikroaerofilik cara 1, maka penampakan koloni spesifik pada media mCCDA terjadi pada hari ketiga 72 jam dan optimal pada hari keempat 96 jam. Tetapi jika menggunakan pengayaan cara 2, maka penampakan koloni spesifik pada media mCCDA terjadi pada hari pertama 24 jam secara mikroaerofilik dan optimal pada hari kedua 48 jam secara mikroaerofilik. Dengan demikian proses pengayaan yang dianjurkan adalah cara 2, menggunakan 2 tahap, yaitu 1 pra pengayaan, yang dimaksudkan untuk memulihkan atau menyelamatkan semua golongan Campylobacter yang dalam kondisi setengah mati atau luka dan dalam kondisi dorman, dan 2 pengayaan, yang dimaksudkan agar hanya Campylobacter termofilik saja yang dapat tumbuh mencapai kondisi optimal dan dapat melakukan perkembangbiakan secara normal serta menghambat pertumbuhan bakteri lain yang mungkin terkontaminasi. Dari data tersebut dapat dikatakan bahwa BHIB maupun Bolton broth tidak ada perbedaan jika digunakan sebagai media pengaya dan begitu pula dengan mCCDA dan Preston agar yang digunakan sebagai media selektif untuk isolasi. 2. Analisa jumlah koloni Campylobacter jejuni Setelah memperoleh kemurnian Campylobacter jejuni pada tahap konfirmasi, selanjutnya dilakukan analisa jumlah koloni yang akan digunakan sebagai inokulum. Bakteri yang digunakan berasal dari kultur murni dari master yang disimpan pada refrigerator dengan ATCC dan batch yang sama. Hasil analisa jumlah koloni Campylobacter jejuni seperti pada Lampiran 1. Suspensi bakteri yang menunjukkan jumlah pertumbuhan + 100 CFUml terdapat pada suspensi pada pengenceran 10 -6 dengan jumlah koloni 114 CFUml. Sehubungan dengan perbedaan waktu yang cukup lama + 1 bulan antara tahap ke-1 dan ke-4, maka kultur stok acuan yang sudah dikonfirmasi kemurniannya tidak digunakan pada tahap ke-4. Hal itu dikhawatirkan terjadinya ketidakstabilan kultur acuan yang disimpan dalam media pengaya BHIB dalam refrigerator. Kultur stok acuan yang digunakan pada tahap ke-4 adalah kultur stok acuan baru dengan sertifikat ATCC dan batch yang sama. Konfirmasi kemurnian tidak dilakukan lagi, dengan merujuk kepada hasil konfirmasi pada uji sebelumnya. Tetapi analisa jumlah koloni Campylobacter jejuni tetap dilakukan agar penetapan inokulum tidak keliru. Hasil analisa jumlah koloni Campylobacter jejuni untuk penetapan inokulum seperti pada lampiran 2. Berdasarkan data pada Lampiran 2, maka suspensi bakteri yang menunjukkan jumlah pertumbuhan + 100 CFUml terdapat pada suspensi pada pengenceran 10 -6 dengan jumlah koloni 111 CFUml. Dengan demikian konsentrasi bakteri Campylobacter jejuni pada master dengan ATCC 33291 berjumlah + 100 juta 10 8 CFUml. B. PENETAPAN INOKULUMSPIKING Konsentrasi Campylobacter jejuni sebanyak 100 juta 10 8 CFUml digunakan sebagai stok. Untuk spiking digunakan suspensi dengan pengenceran 10 -5 yang mengandung konsentrasi Campylobacter jejuni sebanyak 1000 CFUml. Volume pemipetan untuk spiking sebanyak 2,5 ml dimasukkan kedalam 250 ml suspensi sampel daging ayam, sehingga dapat diketahui bahwa setiap gram sampel daging ayam mengandung Campylobacter jejuni dengan konsentrasi +100 CFUgram. Penghitungan konsentrasi Campylobacter jejuni untuk spiking seperti pada Lampiran 3. C. ISOLASI CAMPYLOBACTER JEJUNI PADA DAGING AYAM 1. Hasil isolasi sampel negatif Maksud perlakuan sampel negatif adalah untuk mengetahui apakah sampel tersebut terkontaminasi oleh Campylobacter jejuni atau tidak. Jika pada saat pengujian ditemukan adanya bakteri tersebut berarti sampel daging ayam telah terkontaminasi oleh bakteri tersebut. Sebaliknya, jika tidak teridentifikasi Campylobacter jejuni berarti tidak ada kontaminasi pada sampel. Hasil pengujian seperti pada Tabel 9 dan 10. Tabel 9 Hasil pengujian terhadap sampel negatif dengan media mCCDA JENIS SAMPEL SAMPEL NEGATIF ULANGAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MEDIA HASIL PENGAMATAN Bolton broth + + + + + + + + + + Media Mccda + + + + + + + + + + Morfologi + motilitas + + + + + + + + + + Pertumbuhan 25 C mikroaerofilik - - - - - - - - - - Pertumbuhan 41,5 C aerobik - - - - - - - - - - Oksidase - - - - - - - - - - TSIA + + + + + + + + + + Katalase + + + + + + + + + + Asam nalidiksat - - - - - - - - - - Cefalotin - - - - - - - - - - Hidrolisis hipurat - - - - - - - - - - Hidrolisis indoksil asetat + + + + + + + + + + Kesimpulan : keberadaan C. jejuni - - - - - - - - - - Keterangan : Sampel negatif : sampel daging ayam yang tidak diinokulasikan dengan Campylobacter jejuni + : reaksi positif ; - : reaksi negatif Tabel 10 Hasil pengujian terhadap sampel negatif dengan media Preston agar JENIS SAMPEL SAMPEL NEGATIF ULANGAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MEDIA HASIL PENGAMATAN Bolton broth + + + + + + + + + + Preston agar + + + + + + + + + + Morfologi + motilitas + + + + + + + + + + Pertumbuhan 25 C mikroaerofilik - - - - - - - - - - Pertumbuhan 41,5 C aerobik - - - - - - - - - - Oksidase - - - - - - - - - - TSIA + + + + + + + + + + Katalase + + + + + + + + + + Asam nalidiksat - - - - - - - - - - Cefalotin - - - - - - - - - - Hidrolisis hipurat - - - - - - - - - - Hidrolisis indoksil asetat + + + + + + + + + + Kesimpulan : keberadaan C. jejuni - - - - - - - - - - Keterangan : Sampel negatif : sampel daging ayam yang tidak diinokulasikan dengan Campylobacter jejuni + : reaksi positif ; - : reaksi negatif Tabel 9 dan 10 menunjukkan bahwa pada sampel negatif, koloni yang tumbuh, baik pada media mCCDA maupun pada media Preston agar menunjukkan karakteristik seperti Campylobacter. Tetapi pada tahap konfirmasi, reaksi oksidase menunjukkan hasil negatif. Hampir semua spesies Campylobacter memberikan reaksi positif terhadap uji oksidase. Hal itu disebabkan bakteri tersebut memiliki enzim sitokrom sehingga mampu mengoksidasi tetrametil-p-fenilendiamindihidroklorida. Selain itu pada tahap identifikasi, ada beberapa koloni tidak menunjukkan karakteristik Campylobacter jejuni. Hal itu ditunjukkan dengan perubahan warna pada media TSIA, resisten terhadap asam nalidiksat dan tidak menghidrolisis natrium hipurat. Perubahan warna media pada TSIA menjadi kuning, baik pada butt maupun pada slant menggambarkan bahwa terjadi fermentasi karbohidrat, baik glukosa, laktosa dan sukrosa. Campylobacter jejuni tidak mampu memfermentasi karbohidrat dan tidak memanfaatkan karbohidrat sebagai sumber energi. Selain itu terjadinya resistensi terhadap asam nalidiksat menunjukkan bahwa koloni tersebut bukan termasuk Campylobacter jejuni. Campylobacter jejuni merupakan bakteri yang sensitif terhadap asam nalidiksat dan ditunjukkan dengan zona bening pada dan sekitar cakram sebagai akibat adanya hambatan terhadap pertumbuhan koloni. Tidak terjadinya perubahan warna pada uji hidrolisis natrium hipurat menggambarkan bahwa koloni tersebut bukan tipikal Campylobacter jejuni. Karena Campylobacter jejuni memiliki enzim hippurate hydratase , sehingga dapat menghidrolisis hipurat dan ditunjukkan dengan perubahan warna ungu tua pada substrat. Dengan demikian, dari 10 sampel negatif, semuanya tidak terkontaminasi Campylobacter jejuni. Karakteristik spesifik yang ditunjukkan pada media pengaya, media isolasi, konfirmasi dan identifikasi menunjukkan daging ayam terkontaminasi bakteri lain. 2. Hasil isolasi sampel positif Sampel positif pada penelitian ini dimaksudkan untuk mengetahui kemampuan metode analisa untuk mengisolasi kembali Campylobacter jejuni yang di-spiking dalam sampel. Kemampuan metode analisa tersebut sangat dipengaruhi oleh karakteristik dari daging ayam yang digunakan sebagai sampel. Jika pada saat isolasi ditemukan adanya bakteri tersebut berarti metode analisa tersebut bisa dikatakan spesifik untuk Campylobacter jejuni. Sebaliknya jika pada akhir penelitian tidak dapat diisolasi Campylobacter jejuni atau terisolasi tetapi kurang dari 50 berarti metode analisa tersebut tidak spesifik. Hasil isolasi pada sampel positif seperti pada Tabel 11 dan 12. Tabel 11 Hasil isolasi terhadap sampel positif dengan media mCCDA JENIS SAMPEL SAMPEL POSITIF ULANGAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MEDIA HASIL PENGAMATAN Bolton Broth + + + + + + + + + + Media mCCDA + + + + + + + + + + Morfologi + motilitas + + + + + + + + + + Pertumbuhan 25 C mikroaerofilik - - - - - - - - - - Pertumbuhan 41,5 C aerobik - - - - - - - - - - Oksidase + + + + + + + + + + TSIA - - - + + - - - + - Katalase + + + + + + + + + + Asam nalidiksat + + + - - + + + - + Cefalotin - - - - - - - - - - Hidrolisis hipurat + + + - - + + + - + Hidrolisis indoksil asetat + + + + + + + + + + Kesimpulan : keberadaan C. jejuni + + + - - + + + - + Keterangan: Sampel positif : sampel daging ayam yang diinokulasikan dengan Campylobacter jejuni + : reaksi positif ; - : reaksi negatif Tabel 11 dan 12 menunjukkan bahwa koloni yang tumbuh, baik pada media mCCDA maupun pada media Preston agar menunjukkan karakteristik seperti Campylobacter. Tetapi pada tahap konfirmasi 3 dari 10 sampel yaitu sampel 4, 5 dan 9 menunjukkan reaksi oksidase negatif pada media Preston agar sedangkan pada media mCCDA dari 10 sampel, semuanya menunjukkan reaksi oksidase positif. Terjadinya perbedaan hasil oksidase pada kedua media tersebut mungkin mengindikasikan bahwa media mCCDA lebih selektif dari Preston agar. Hal itu disebabkan karena adanya sedikit perbedaan pada komposisi media dan antibiotik yang digunakan sebagai suplemen. Tabel 12 Hasil isolasi terhadap sampel positif dengan media Preston agar JENIS SAMPEL SAMPEL POSITIF ULANGAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MEDIA HASIL PENGAMATAN Bolton broth + + + + + + + + + + Preston agar + + + + + + + + + + Morfologi dan motilitas + + + + + + + + + + Pertumbuhan 25 C mikroaerofilik - - - - - - - - - - Pertumbuhan 41,5 C aerobik - - - - - - - - - - Oksidase + + + - - + + + - + TSIA - - - + + - - - + - Katalase + + + + + + + + + + Asam nalidiksat + + + - - + + + - + Cefalotin - - - - - - - - - - Hidrolisis hipurat + + + - - + + + - + Hidrolisis indoksil asetat + + + + + + + + + + Kesimpulan : keberadaan C. jejuni + + + - - + + + - + Keterangan : Sampel positif : sampel daging ayam yang diinokulasikan dengan Campylobacter jejuni + : reaksi positif ; - : reaksi negatif Pada tahap identifikasi, 3 dari 10 sampel, koloni yang diisolasi tidak menunjukkan karakteristik Campylobacter jejuni. Hal itu ditunjukkan dengan perubahan warna pada media TSIA, resisten terhadap asam nalidiksat dan tidak menghidrolisis natrium hipurat. Perubahan warna media pada TSIA menjadi kuning, baik pada butt maupun pada slant, menggambarkan bahwa terjadi fermentasi karbohidrat, baik glukosa, laktosa dan sukrosa. Campylobacter jejuni tidak mampu memfermentasi karbohidrat dan tidak memanfaatkan karbohidrat sebagai sumber energi. Selain itu terjadinya resistensi terhadap asam nalidiksat menunjukkan bahwa koloni tersebut bukan termasuk Campylobacter jejuni. Karena Campylobacter jejuni merupakan bakteri yang sensitif terhadap asam nalidiksat dan ditunjukkan dengan zona bening pada dan sekitar cakram sebagai akibat adanya hambatan terhadap pertumbuhan koloni. Tidak terjadinya perubahan warna pada uji hidrolisis natrium hipurat menggambarkan bahwa koloni tersebut bukanlah tipikal Campylobacter jejuni. Campylobacter jejuni memiliki enzim hippurate hydratase , sehingga dapat menghidrolisis hipurat dan ditunjukkan dengan perubahan warna ungu tua pada substrat. Dengan demikian dalam penelitian ini, 7 dari 10 sampel positif, menunjukkan karakteristik Campylobacter jejuni yaitu sampel 1,2,3,6,7,8, dan 10. Sedangkan 3 sampel yaitu 4, 5, dan 9 tidak menunjukkan karakteristik Campylobacter jejuni. Karakteristik spesifik yang ditunjukan pada media pengaya, media isolasi, konfirmasi dan identifikasi pada ketiga sampel tersebut menunjukkan adanya kontaminasi bakteri lain. Pada ketiga sampel tersebut Campylobacter jejuni tidak dapat diisolasi sebagai akibat adanya faktor penghambat yang terdapat pada sampel. Meskipun terjadi perbedaan pada uji oksidase, baik media selektif mCCDA maupun Preston agar memberikan hasil akhir yang sama sehingga tidak terjadi perbedaan. 3. Hasil isolasi kontrol positif Kontrol positif dalam perlakuan ini bertujuan untuk mengetahui selektivitas penggunaan media, pereaksi dan kondisi atmosfer. Pada perlakuan ini sengaja tidak ditambahkan sampel, agar penambahan inokulum pada media pengaya Bolton broth tidak ada kompetisi yang dapat menghambat pertumbuhan Campylobacter jejuni. Diharapkan Campylobacter jejuni dapat diisolasi kembali seluruhnya. Jika pada saat pengujian, Campylobacter jejuni tidak terisolasi atau terisolasi tetapi tidak seluruhnya maka tahap isolasi ini dianggap tidak valid. Hal itu dapat terjadi akibat kesalahan dalam preparasi, baik preparasi media, peralatan, maupun kondisi lingkungan dan juga karena kemampuan analis. Hasil isolasi terhadap kontrol positif seperti pada Tabel 13 dan 14. Berdasarkan Tabel 13 dan 14, dapat diketahui bahwa koloni yang tumbuh, baik pada media pengaya, isolasi, konfirmasi maupun tahap identifikasi menunjukkan karakteristik Campylobacter jejuni. Dengan demikian 10 kontrol positif, semuanya terisolasi kembali Campylobacter jejuni . Tabel 13 Hasil isolasi terhadap kontrol positif dengan media mCCDA JENIS SAMPEL KONTROL POSITIF ULANGAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MEDIA HASIL PENGAMATAN Bolton broth + + + + + + + + + + Media mCCDA + + + + + + + + + + Morfologi dam motilitas + + + + + + + + + + Pertumbuhan 25 C mikroaerofilik - - - - - - - - - - Pertumbuhan 41,5 C aerobik - - - - - - - - - - Oksidase + + + + + + + + + + TSIA - - - - - - - - - - Katalase + + + + + + + + + + Asam nalidiksat + + + + + + + + + + Cefalotin - - - - - - - - - - Hidrolisis hipurat + + + + + + + + + + Hidrolisis indoksil asetat + + + + + + + + + + Kesimpulan : keberadaan C. jejuni + + + + + + + + + + Keterangan : Kontrol positif : Inokulum Campylobacter jejuni + : reaksi positif ; - : reaksi negatif Tabel 14 Hasil pengujian terhadap kontrol positif dengan media Preston agar JENIS SAMPEL KONTROL POSITIF ULANGAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MEDIA HASIL PENGAMATAN Bolton broth + + + + + + + + + + Preston agar + + + + + + + + + + Morfologi dan motilitas + + + + + + + + + + Pertumbuhan 25 C mikroaerofilik - - - - - - - - - - Pertumbuhan 41,5 C aerobik - - - - - - - - - - Oksidase + + + + + + + + + + TSIA - - - - - - - - - - Katalase + + + + + + + + + + Asam nalidiksat + + + + + + + + + + Cefalotin - - - - - - - - - - Hidrolisis hipurat + + + + + + + + + + Hidrolisis indoksil asetat + + + + + + + + + + Kesimpulan : keberadaan C. jejuni + + + + + + + + + + Keterangan : Kontrol positif : inokulum Campylobacter jejuni + : reaksi positif ; - : reaksi negatif D. ANALISIS VALIDASI SEKUNDER Tabel 11 dan 12 menunjukkan bahwa 7 dari 10 sampel positif menunjukkan Campylobacter jejuni dapat diisolasi kembali. Tabel 14 dan 15, menunjukkan bahwa dari 10 kontrol positif, semuanya terisolasi kembali Campylobacter jejuni. Dengan demikian validasi sekunder metode analisa menghasilkan recovery sebesar 70. Salah satu parameter kevalidan metode analisa ditentukan dengan spesifisitas. Spesifisitas diukur dengan nilai recovery. Suatu metode analisa dikatakan valid jika nilai recovery 50 AOAC 1999. Dengan demikian metode analisa yang dikembangkan oleh ISO dapat diadopsi untuk keperluan laboratorium. Hal itu berdasarkan hasil validasi sekunderverifikasi yang menunjukkan tingkat recovery sebesar 70. Metode analisa tersebut dapat diterapkan dalam pengujian. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pertumbuhan Campylobacter jejuni pada bahan pangan. Mossel 1971 menjelaskan bahwa pertumbuhan mikroba dalam bahan pangan dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain faktor internal, faktor pengolahan, faktor eksternal dan faktor implisit. Faktor internal terdiri atas aktivitas air a w , nilai pH, potensial redoks, zat gizi, bahan antimikroba yang terdapat secara alamiah dan struktur biologis. Faktor pengolahan antara lain pemanasan, pembekuan, penggaraman, dan sebagainya. Faktor eksternal meliputi suhu, oksigen, dan kelembaban. Sedangkan faktor implisit merupakan adanya berbagai macam mikroba didalam bahan pangan yang saling mempengaruhi. Faktor yang paling mungkin menghambat pertumbuhan Campylobacter jejuni adalah kompetisi dengan mikroba lain yang mengontaminasi daging ayam sejak awal. Hal itu dapat terjadi sebagai akibat kontaminasi bakteri lain sejak awal sangat tinggi pada daging ayam, sehingga inokulum Campylobacter jejuni yang ditambahkan tidak mampu berkompetisi. Hal itu dibuktikan dengan adanya pertumbuhan koloni pada sampel negatif. Gun-Monroe et al.1987 dalam Bridson 1998, berdasarkan hasil evaluasi klinis dan laboratorium terhadap beberapa media isolasi Campylobacter, menyampaikan data keefektifan media isolasi Campylobacter seperti pada Tabel 15 dan 16. Tabel 15 Recovery 70 strain Campylobacter jejuni pada lima media selektif Media Jumlah koloni P value b Blood agar kontrol 7,95 + 0,36 Skirrow 7,82 + 0,48 NS c Butzler 7,77 + 0,51 0,05 Blasser-Wang 7,70 + 0,56 0,05 Preston 7,76 + 0,52 0,05 Media mCCDA 7,91 + 0,36 NS Sumber : Bridson 1998 Keterangan: Signifikansi b ditentukan dengan t-student untuk sampel tidak berpasangan NS c , tidak signifikan Tabel 16 Isolasi Campylobacter jejuni 70 sampel feses positif tersimulasi Media 24 jam secara mikroaerofilik 48 jam secara mikroaerofilik Blood agar kontrol 69 99 70 100 Skirrow 39 56 67 96 Butzler 38 54 60 86 Blasser-Wang 17 24 31 41 Preston 32 46 64 91 Modified CCDA 61 87 69 99 Sumber : Bridson 1998 Tabel 16 menunjukkan bahwa dengan metode kuantitatif, penggunaan media selektif mCCDA dan Skirrow memberikan recovery yang sangat tinggi dengan tidak menunjukkan perbedaan secara signifikan terhadap kontrol. Sedangkan media spesifik lain Butzler, Blasser-Wang dan Preston menunjukkan adanya perbedaan yang sangat kecil terhadap kontrol Tabel 17 juga menunjukkan bahwa selain media selektif mCCDA dan Skirrow, Preston agar juga memberikan Recovery yang cukup tinggi yaitu diatas 90. Sedangkan satu-satunya media selektif yang menghasilkan recovery dibawah 50 adalah Blasser-Wang. Dengan demikian pemilihan media selektif pada pengujian ini baik mCCDA maupun Preston agar dapat dipercaya dan memberikan hasil yang cukup meyakinkan untuk isolasi Campylobacter jejuni. V. PENUTUP A. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa bakteri Campylobacter jejuni dari master kultur stok acuan dengan nomor sertifikat ATCC 33291, setelah diinkubasi pada suhu 37 C selama 4 jam dan 41,5 C selama 44 jam secara mikroaerofilik, terkonfirmasi kemurniannya menggunakan metode ISO 10272 2006 bagian 1. Hasil isolasi terhadap sampel negatif pada validasi sekunder menunjukkan bahwa pada 10 sampel yang diisolasi, Campylobacter jejuni semuanya tidak terisolasi, sedangkan pada 7 dari 10 sampel positif, Campylobacter jejuni dapat terisolasi kembali, dan 3 sampel tidak terisolasi kembali, serta hasil isolasi dari 10 kontrol positif, Campylobacter jejuni semuanya terisolasi kembali sehingga hasil validasi sekunder metode analisa Campylobacter jejuni pada daging ayam berdasarkan metode analisa ISO 10272 2006 bagian 1 memberikan recovery sebesar 70 dengan limit deteksi 100 CFUgram, dan dapat diterapkan dalam pengujian laboratorium. C. SARAN Untuk melihat sensitivitas metode analisa Campylobacter jejuni, disarankan untuk melakukan penelitian lanjutan menggunakan parameter uji limit deteksi dengan jumlah inokulum dibawah 100 CFUml. Untuk melihat sensitivitas dan spesifisitas metode analisa Campylobacter jejuni, disarankan juga dilakukan verifikasi metode analisa yang dikembangkan oleh organisasi lain seperti BAM dan lain-lain. DAFTAR PUSTAKA Abdy I. 2007. Isolasi Campylobacter jejuni pada Karkas Ayam dan Uji Efektivitas Klorin-Asam Asetat sebagai Sanitaiser terhadap Campylobacter jejuni dengan Metode Suspension Test. Skripsi. Bogor. Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor. Adriani, Noer SM, Poeloengan M dan Supar. 2006. Pengembangan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay untuk Deteksi Campylobacter jejuni pada Daging Ayam. Disampaikan pada Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Balai Besar Penelitian Veteriner. Bogor. Altekruse SF, Stern NJ, Fields PI dan Swerdlow DI. 1999. Campylobacter jejuni- An Emerging Foodborne Pathogen. J, Emerging Infectious Desease Vol 5 1:23-29. Anonim. 2008. Campylobacter jejuni. http:genetics.med.harvard.edu~perrimonCampylobacter-jejuni.jpg [AMM] Association of Medical Microbiologisis. 1993. Campylobacter. http:www.facts about_Campylobacter.html [15 Februari 2008]. [AOAC] Association of Analitycal Chemists. 1999. AOAC International Qualitative and Quantitative Microbiology Guidelines for Methods Validation. Journal of AOAC International vol. 62. No. 2. USA. BAM Bacterilogical Analitical Manual. 1995. Method for Detection of Enumeration of Staphylococcus aureus. AOAC International 8 th Edition. USA Bailey JS. 1993. Control of Salmonella and Campylobacter in Poultry Production. A Summary of Work at Research Center. Poult.Sci. 72; 1169 – 1173. Banwart GJ. 1989. Basic Food Microbiology 2 nd Edition. Chapman and Hall. New York. Bolton FJ and Robertson L. 1982. A selective medium for isolating Campylobacter jejunicoli . J. Clin.Pathol.35.462-467. Bridson EY.1998. The Oxoid Manual 8 th edition.Oxoid Limited.Wade Road.Basingstoke.Hampshire.,England. [BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2000. Standar Nasional Indonesia Nomor 01- 6366-2000. Karkas Ayam Pedaging. Jakarta. Badan Standardisasi Nasional Indonesia. Doyle MP.1989. Foodborne Bacterial Pathogens. Food Research Institute. Illustrated Edition. Marcel Deckel. [DPL] PT. Dipa Puspa Labsains. 2008. MicroBiologics. Quality Control Microorganisms. DPL-MKTPM-MIKRO02VI08 Hadioetomo RS.1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT. Gramedia. Jakarta. Hu L dan Kopecko DJ. 2003. Campylobacter spesies. Di dalam Miliotis MD dan Bier JF eds. International Handbook of Foodborne Pathogens. Marcel Decker Inc. New York. Irianto K. 2006. Mikrobiologi. Menguak Dunia Mikroorganisme. Jilid 1. Bandung. Yrama Widya. Cetakan pertama. Irianto K. 2007. Mikrobiologi. Menguak Dunia Mikroorganisme. Jilid 2. Bandung. Yrama Widya. Cetakan kedua. [ISO] International Organisation for Standardisation. 2006 E, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs-Horizontal Method for Detection of Thermotolerant detection and enumeration of Campylobacter spp,1st edition 2006- 01-15. International Organisation for Standardisation ISO 10272. Jaya U. 2007. Agribisnis ayam perlu lebih proaktif. http:tabloid_agrina.co.id [10 Mei 2008]. Khoirudin MN. 2008. Penentuan Prevalensi Cemaran Campylobacter jejuni Sampel Potongan Karkas Ayam di Wilayah Bogor dan Jakarta Menggunakan Metode Modifikasi BAM 2001. Skripsi. Bogor. Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor. McClure P and C. Blackburn. 2003. Campylobacter and Arcobacter. Foodborne Pathogens Hazard. Risk Analysis and Control. Woodhead Publishing Limited. Cambridge. England. Merck. 2003. Anaerocult C. Microbiologia. Darmstadt. Germany. Mossel DAA. 1971. Physiological and Metabolic Attributes of Microbial Groups Associated With Foods. J. Appl.Bacteriol. 34,95 - 118. Bekirjop dan Doyle A. 1991. Maintenance of Microorganisms and Culture Cells. A Manual of Laboratory Methods. Second Edition. Academic Press Limited. Sac-Singlas. 2002. Validasi Metode dari Metode-metoda Mikrobiologi. Guidance Note: C B and ENV 002. Schmidt K and Tirado C. 2001. WHO Surveilance Programme for Control of Foodborne Infection and Intoxications in Europe. Federal Institute for Health Protection of Consumers and Veterinary Medicine.Berlin. Sigma A. 2008. Products for Life Science Research 2008-2009. Siregar CJP. 2007. Praktik Sistem Manajemen Laboratorium-Pengujian yang Baik Good Testing-Laboratory Management System Practice. Jakarta.Penerbit Buku Kedokteran EGP. Cetakan pertama. Stern NJ and Line JE. 2000. Campylobacter. Dalam Lund DM,Baird-Parker TC and Gould GW. The Microbiological Safety and Quality of Food. Vol. II. An Aspen Publication. Sukarno S. 2005. Validasi dan Verifikasi Metode Analisa. Disampaikan pada Pertemuan Manajer Mutu dan Manajer Teknis Laboratorium Badan POM RI di Medan. Jakarta. Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional. Badan POM RI. [USP] The United States Pharmacopeia. 2007. 30 NF 25 Volume 1. The United States Pharmacopeial Convection 12601 Twinbrook Parkway. MD 20852. The Swedish Institute for Infectious Disease Control. 2008. Campylobacteriosis. Nobels vag 18, 171 82 Solna. http:www.smittskyddsinstitutet.sein-english[15 Mei 2009]. Tjaniadi P. et.al. 2003. Antimicrobial Resistance of Bacterial Pathogens Assoaciated with Diarrheal Patients in Indonesia. J. Trop. Med.Hyg.Vol 686:666-670. Udin Z. 2007. Validasi Analisis Mikrobiologi. disampaikan pada Kursus Teknik Analisis Kontaminan Mikroba di Tempat Kerja. Pusat Penelitian Kimia Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Bandung. Lampiran 1 Analisa jumlah koloni Campylobacter jejuni Pengenceran Volume suspensi pada petridish Total 0,3 ml 0,3 ml 0,4 ml 1 ml 10 -1 tt tt tt Tt 10 -2 tt tt tt Tt 10 -3 tt tt tt tt 10 -4 tt tt tt tt 10 -5 tt tt tt tt 10 -6 37 35 42 114 10 -7 5 5 8 18 10 -8 0 0 1 1 Keterangan : tt : koloni tidak dapat dihitung Lampiran 2 Analisa jumlah koloni Campylobacter jejuni Pengenceran Volume suspensi pada petridish Total 0,3 ml 0,3 ml 0,4 ml 1 ml 10 -1 tt tt tt tt 10 -2 tt tt tt tt 10 -3 tt tt tt tt 10 -4 tt tt tt tt 10 -5 tt tt tt tt 10 -6 36 34 41 111 10 -7 4 5 8 17 10 -8 0 0 1 1 Keterangan : tt : koloni tidak dapat dihitung Lampiran 3 Penetapan suspensi Campylobacter jejuni sebagai inokulum 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 Jumlah CFU 100 juta 10 juta 1 juta 100 ribu 10 ribu 1000 100 10 Pengenceran Stok 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 ABSTRACT TAMRAN ISMAIL. Secondary Validation on the Analysis Method of Campylobacter jejuni on Chicken Meat. Under direction of HARSI D. KUSUMANINGRUM and RATIH DEWANTI-HARIYADI. Campylobacter jejuni is a pathogenic bacterium that often contaminates food and causes food-borne diseases. It is reported that more than 50 of uncooked chicken meat in the U.S. market is contaminated with Campylobacter, but in Indonesia there has not been much information on such report. To determine the contamination level of Campylobacter jejuni on chicken meat, a valid method of analysis should be available in the laboratory. To adopt an existing valid method of analysis, a secondary validation is needed. The objective of this research was to conduct a secondary validation on the analysis method of Campylobacter jejuni according to the ISO 10272 2006. The study was carried out from January to March 2009 in the microbiology laboratory of the national quality control laboratory of drug and food-National Agency of Drug and Food Control NADFC Indonesia. A laboratory experiment was carried out using three treatments negative samples, positive samples, and positive controls with ten replications. The experiment consisted of the following steps: preparation of testing culture to ensure the purity and the number of colonies of Campylobacter jejuni in the culture, determining the inoculum spiking, preparation of chicken meat samples negative and positive samples, and isolation of Campylobacter jejuni from chicken meat. The parameter observed in the secondary validation was the specifity of the method that is indicated by the recovery value. The research results showed that the culture of Campylobacter jejuni was pure thus it could be used as inoculum, all negative samples were uncontaminated by Campylobacter jejuni, Campylobacter jejuni could be reisolated on seven of ten positive samples, and Campylobacter jejuni could be reisolated on all positive controls. The secondary validation resulted in the recovery value of 70. According to AOAC 1999 an analysis method can be adopted by a laboratory if it has the recovery value of 50, Keywords:secondary validation, campylobacter jejuni, Analysis method,chicken meat RINGKASAN TAMRAN ISMAIL. Validasi Sekunder Metode Analisa Campylobacter jejuni pada Daging Ayam. Dibimbing oleh HARSI D. KUSUMANINGRUM dan RATIH DEWANTI-HARIYADI. Foodborne disease penyakit akibat pangan merupakan suatu penyakit yang diderita oleh seseorang akibat mengonsumsi makanan yang telah terkontaminasi bahan kimia beracun atau mikroba patogen. Salah satu gejala foodborne disease akibat kontaminasi mikroba patogen yaitu diare. Salmonella spp, Shigella spp dan Campylobacter spp merupakan bakteri-bakteri patogen penyebab diare yang banyak diderita oleh masyarakat. Mikroorganisme tersebut paling banyak ditemukan pada bahan pangan mentah berupa daging unggas, telur, susu, ikan dan sayuran. Campylobacter jejuni merupakan salah satu bakteri patogen yang sering mengontaminasi bahan pangan. Bakteri ini dapat mengontaminasi bahan pangan melalui kotoran ternak, selama proses pemerahan atau infeksi pada puting susu, unggas yang terinfeksi dan air yang tercemar Stern dan Line 2000. Kasus penyakit diare akibat terinfeksi bakteri Campylobacter dibeberapa negara telah banyak dilaporkan, misalnya di Amerika Serikat dilaporkan sekitar 2,5 juta penderita campylobacteriosis dan 124 penderita meninggal dunia setiap tahunnya Hu dan Kopecko 2003. Pada tahun 1998 kasus infeksi Campylobacter juga dilaporkan di Belanda sebanyak 3.398 kasus, di Denmark sebanyak 3.372 kasus, di Spanyol sebanyak 4.382 kasus Schmidt et al. 2001. The Swedish Institute for Infection Desease Control 2008 melaporkan bahwa pada tahun 2007 total 7.106 kasus campylobacteriosis terjadi di Swedia, dengan 77,45 kasus setiap 100.000 populasi. Sedangkan di Indonesia, dari 21.763 penderita diare sekitar 3,6 nya disebabkan karena Campylobacter jejuni Tjaniadi et al. 2003. Tujuan umum dalam penelitian ini adalah untuk melakukan verifikasivalidasi sekunder metode analisa Campylobacter jejuni sesuai ISO 10272 2006, sehingga dapat digunakan untuk analisis terhadap daging ayam di Indonesia dan penelitian ini juga memiliki tujuan khusus yaitu melakukan konfirmasi kemurnian Campylobacter jejuni yang akan digunakan dalam validasi sekunder dan melakukan validasi sekunder metode analisa kualitatif Campylobacter jejuni dengan parameter uji spesifisitas. Dengan dilakukan penelitian ini, diharapkan dapat diperoleh keabsahan validitas metode analisa Campylobacter jejuni pada daging ayam sehingga dapat diadopsi di Indonesia. Berdasarkan hasil penelitian dapat diketahui bahwa Campylobacter jejuni pada kultur stok dengan sertifikat ATCC 33291 terkonfirmasi kemurniannya. Hal itu dibuktikan dengan kesesuaian karakterisitik spesifik yang ditunjukkan pada media dan pereaksi yang digunakan serta kondisi mikroaerofilik yang diterapkan dalam pengujian konfirmasi dengan metode analisa yang akan diadopsi. Dengan demikian Campylobacter jejuni tersebut dapat digunakan dalam pengujian validasi sekunder. Hasil analisa jumlah koloni Campylobacter jejuni menunjukkan bahwa konsentrasi bakteri Campylobacter jejuni pada master dengan ATCC 33291 berjumlah + 100 juta 10 8 CFUml dan digunakan sebagai stok. Untuk spiking digunakan suspensi dengan pengenceran 10 -5 yang mengandung 1000 CFUml inokulum Campylobacter jejuni. Agar sampel daging ayam mengandung Campylobacter jejuni dengan konsentrasi 2500 CFUml atau +100 CFUgram, inokulum Campylobacter jejuni dipipet sebanyak 2,5 ml dan dimasukan kedalam 250 ml suspensi sampel daging ayam. Hasil pengujian sampel negatif menunjukkan bahwa pada sampel negatif, koloni yang tumbuh baik pada media mCCDA maupun pada media Preston agar menunjukkan karakteristik seperti Campylobacter, tetapi pada tahap konfirmasi, reaksi oksidase menunjukkan hasil negatif. Hampir semua spesies Campylobacter memberikan reaksi positif terhadap uji oksidase. Selain itu, pada tahap identifikasi ada beberapa koloni tidak menunjukkan karakteristik Campylobacter jejuni. Hal itu ditunjukkan dengan perubahan warna pada media TSIA, resisten terhadap asam nalidiksat dan tidak menghidrolisis natrium hipurat. Dengan demikian 10 sampel negatif, semuanya tidak terkontaminasi Campylobacter jejuni. Karakteristik spesifik yang ditunjukkan pada media pengaya, media isolasi, konfirmasi dan identifikasi menunjukkan adanya kontaminasi bakteri lain. Hasil pengujian sampel positif dapat diketahui bahwa koloni yang tumbuh, baik pada media mCCDA maupun pada media Preston agar menunjukkan karakteristik seperti Campylobacter. Tetapi pada tahap konfirmasi, 3 dari 10 sampel positif yaitu sampel 4, 5 dan 9 menunjukkan reaksi oksidase negatif pada media Preston agar sedangkan pada media mCCDA dari 10 sampel, semuanya menunjukkan reaksi oksidase positif. Terjadinya perbedaan hasil oksidase pada kedua media tersebut mungkin mengindikasikan bahwa media mCCDA lebih selektif dari Preston agar. Hal itu disebabkan karena adanya sedikit perbedaan pada komposisi media dan antibiotik yang digunakan sebagai suplemen. Pada tahap identifikasi 3 dari 10 sampel positif yaitu sampel 4, 5 dan 9, koloni yang diidentifikasi tidak menunjukkan karakteristik Campylobacter jejuni. Hal itu ditunjukkan dengan perubahan warna pada media TSIA, resisten terhadap asam nalidiksat dan tidak menghidrolisis natrium hipurat. Dengan demikian pada 7 dari 10 sampel positif, Campylobacter jejuni dapat terisolasi kembali sedangkan pada 3 sampel tidak dapat terisolasi kembali. Hasil pengujian terhadap kontrol positif menunjukkan bahwa koloni yang tumbuh, baik pada media pengaya sampai uji identifikasi semuanya menunjukkan karakteristik Campylobacter jejuni. Dengan demikian pada 10 kontrol positif, Campylobacter jejuni semuanya dapat terisolasi kembali. Berdasarkan hasil pengujian tersebut maka dapat ditunjukkan bahwa validasi sekunder menghasilkan nilai recovery sebesar 70. Pertumbuhan Campylobacter jejuni sangat dipengaruhi oleh karakteristik daging ayam yang digunakan sebagai sampel. Karakteristik tersebut dapat mempercepat laju pertumbuhan Campylobacter jejuni tetapi dapat juga menghambat pertumbuhannya., antara lain : ketersediaan nutrisi, aktivitas air Aw, nilai pH, bahan anti mikroba dan potensial redoks. Selain itu, kontaminasi mikroba lain selama proses penanganan daging ayam juga dapat menghambat pertumbuhan Campylobacter jejuni. Faktor penghambat tersebut yang mungkin menyebabkan inokulum yang di-spike tidak dapat diisolasi kembali seluruhnya 100. Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa kultur Campylobacter jejuni pada kultur stok dengan sertifikat ATCC 33291, terkonfirmasi kemurniannya. Hasil isolasi terhadap sampel negatif menunjukkan bahwa dari 10 sampel yang diisolasi semuanya tidak terkontaminasi Campylobacter jejuni, sedangkan pada 7 dari 10 sampel positif, Campylobacter jejuni dapat terisolasi kembali, dan 3 sampel tidak terisolasi kembali, serta hasil isolasi pada 10 kontrol positif, Campylobacter jejuni semuanya terisolasi kembali sehingga hasil validasi sekunder metode analisa Campylobacter jejuni pada daging ayam berdasarkan metode analisa ISO 10272 2006 bagian 1 memberikan recovery sebesar 70 dengan limit deteksi 100 CFUgram, dan dapat diterapkan dalam pengujian laboratorium. Untuk melihat sensitivitas metode analisa Campylobacter jejuni, disarankan untuk melakukan penelitian lanjutan menggunakan parameter uji limit deteksi dengan jumlah spike dibawah 100 CFUml, validasi sekunder juga dilakukan terhadap metode analisa yang dikembangkan oleh organisasi lain seperti BAM. ABSTRACT TAMRAN ISMAIL. Secondary Validation on the Analysis Method of Campylobacter jejuni on Chicken Meat. Under direction of HARSI D. KUSUMANINGRUM and RATIH DEWANTI-HARIYADI. Campylobacter jejuni is a pathogenic bacterium that often contaminates food and causes food-borne diseases. It is reported that more than 50 of uncooked chicken meat in the U.S. market is contaminated with Campylobacter, but in Indonesia there has not been much information on such report. To determine the contamination level of Campylobacter jejuni on chicken meat, a valid method of analysis should be available in the laboratory. To adopt an existing valid method of analysis, a secondary validation is needed. The objective of this research was to conduct a secondary validation on the analysis method of Campylobacter jejuni according to the ISO 10272 2006. The study was carried out from January to March 2009 in the microbiology laboratory of the national quality control laboratory of drug and food-National Agency of Drug and Food Control NADFC Indonesia. A laboratory experiment was carried out using three treatments negative samples, positive samples, and positive controls with ten replications. The experiment consisted of the following steps: preparation of testing culture to ensure the purity and the number of colonies of Campylobacter jejuni in the culture, determining the inoculum spiking, preparation of chicken meat samples negative and positive samples, and isolation of Campylobacter jejuni from chicken meat. The parameter observed in the secondary validation was the specifity of the method that is indicated by the recovery value. The research results showed that the culture of Campylobacter jejuni was pure thus it could be used as inoculum, all negative samples were uncontaminated by Campylobacter jejuni, Campylobacter jejuni could be reisolated on seven of ten positive samples, and Campylobacter jejuni could be reisolated on all positive controls. The secondary validation resulted in the recovery value of 70. According to AOAC 1999 an analysis method can be adopted by a laboratory if it has the recovery value of 50, Keywords:secondary validation, campylobacter jejuni, Analysis method,chicken meat RINGKASAN TAMRAN ISMAIL. Validasi Sekunder Metode Analisa Campylobacter jejuni pada Daging Ayam. Dibimbing oleh HARSI D. KUSUMANINGRUM dan RATIH DEWANTI-HARIYADI. Foodborne disease penyakit akibat pangan merupakan suatu penyakit yang diderita oleh seseorang akibat mengonsumsi makanan yang telah terkontaminasi bahan kimia beracun atau mikroba patogen. Salah satu gejala foodborne disease akibat kontaminasi mikroba patogen yaitu diare. Salmonella spp, Shigella spp dan Campylobacter spp merupakan bakteri-bakteri patogen penyebab diare yang banyak diderita oleh masyarakat. Mikroorganisme tersebut paling banyak ditemukan pada bahan pangan mentah berupa daging unggas, telur, susu, ikan dan sayuran. Campylobacter jejuni merupakan salah satu bakteri patogen yang sering mengontaminasi bahan pangan. Bakteri ini dapat mengontaminasi bahan pangan melalui kotoran ternak, selama proses pemerahan atau infeksi pada puting susu, unggas yang terinfeksi dan air yang tercemar Stern dan Line 2000. Kasus penyakit diare akibat terinfeksi bakteri Campylobacter dibeberapa negara telah banyak dilaporkan, misalnya di Amerika Serikat dilaporkan sekitar 2,5 juta penderita campylobacteriosis dan 124 penderita meninggal dunia setiap tahunnya Hu dan Kopecko 2003. Pada tahun 1998 kasus infeksi Campylobacter juga dilaporkan di Belanda sebanyak 3.398 kasus, di Denmark sebanyak 3.372 kasus, di Spanyol sebanyak 4.382 kasus Schmidt et al. 2001. The Swedish Institute for Infection Desease Control 2008 melaporkan bahwa pada tahun 2007 total 7.106 kasus campylobacteriosis terjadi di Swedia, dengan 77,45 kasus setiap 100.000 populasi. Sedangkan di Indonesia, dari 21.763 penderita diare sekitar 3,6 nya disebabkan karena Campylobacter jejuni Tjaniadi et al. 2003. Tujuan umum dalam penelitian ini adalah untuk melakukan verifikasivalidasi sekunder metode analisa Campylobacter jejuni sesuai ISO 10272 2006, sehingga dapat digunakan untuk analisis terhadap daging ayam di Indonesia dan penelitian ini juga memiliki tujuan khusus yaitu melakukan konfirmasi kemurnian Campylobacter jejuni yang akan digunakan dalam validasi sekunder dan melakukan validasi sekunder metode analisa kualitatif Campylobacter jejuni dengan parameter uji spesifisitas. Dengan dilakukan penelitian ini, diharapkan dapat diperoleh keabsahan validitas metode analisa Campylobacter jejuni pada daging ayam sehingga dapat diadopsi di Indonesia. Berdasarkan hasil penelitian dapat diketahui bahwa Campylobacter jejuni pada kultur stok dengan sertifikat ATCC 33291 terkonfirmasi kemurniannya. Hal itu dibuktikan dengan kesesuaian karakterisitik spesifik yang ditunjukkan pada media dan pereaksi yang digunakan serta kondisi mikroaerofilik yang diterapkan dalam pengujian konfirmasi dengan metode analisa yang akan diadopsi. Dengan demikian Campylobacter jejuni tersebut dapat digunakan dalam pengujian validasi sekunder. Hasil analisa jumlah koloni Campylobacter jejuni menunjukkan bahwa konsentrasi bakteri Campylobacter jejuni pada master dengan ATCC 33291 berjumlah + 100 juta 10 8 CFUml dan digunakan sebagai stok. Untuk spiking digunakan suspensi dengan pengenceran 10 -5 yang mengandung 1000 CFUml inokulum Campylobacter jejuni. Agar sampel daging ayam mengandung Campylobacter jejuni dengan konsentrasi 2500 CFUml atau +100 CFUgram, inokulum Campylobacter jejuni dipipet sebanyak 2,5 ml dan dimasukan kedalam 250 ml suspensi sampel daging ayam. Hasil pengujian sampel negatif menunjukkan bahwa pada sampel negatif, koloni yang tumbuh baik pada media mCCDA maupun pada media Preston agar menunjukkan karakteristik seperti Campylobacter, tetapi pada tahap konfirmasi, reaksi oksidase menunjukkan hasil negatif. Hampir semua spesies Campylobacter memberikan reaksi positif terhadap uji oksidase. Selain itu, pada tahap identifikasi ada beberapa koloni tidak menunjukkan karakteristik Campylobacter jejuni. Hal itu ditunjukkan dengan perubahan warna pada media TSIA, resisten terhadap asam nalidiksat dan tidak menghidrolisis natrium hipurat. Dengan demikian 10 sampel negatif, semuanya tidak terkontaminasi Campylobacter jejuni. Karakteristik spesifik yang ditunjukkan pada media pengaya, media isolasi, konfirmasi dan identifikasi menunjukkan adanya kontaminasi bakteri lain. Hasil pengujian sampel positif dapat diketahui bahwa koloni yang tumbuh, baik pada media mCCDA maupun pada media Preston agar menunjukkan karakteristik seperti Campylobacter. Tetapi pada tahap konfirmasi, 3 dari 10 sampel positif yaitu sampel 4, 5 dan 9 menunjukkan reaksi oksidase negatif pada media Preston agar sedangkan pada media mCCDA dari 10 sampel, semuanya menunjukkan reaksi oksidase positif. Terjadinya perbedaan hasil oksidase pada kedua media tersebut mungkin mengindikasikan bahwa media mCCDA lebih selektif dari Preston agar. Hal itu disebabkan karena adanya sedikit perbedaan pada komposisi media dan antibiotik yang digunakan sebagai suplemen. Pada tahap identifikasi 3 dari 10 sampel positif yaitu sampel 4, 5 dan 9, koloni yang diidentifikasi tidak menunjukkan karakteristik Campylobacter jejuni. Hal itu ditunjukkan dengan perubahan warna pada media TSIA, resisten terhadap asam nalidiksat dan tidak menghidrolisis natrium hipurat. Dengan demikian pada 7 dari 10 sampel positif, Campylobacter jejuni dapat terisolasi kembali sedangkan pada 3 sampel tidak dapat terisolasi kembali. Hasil pengujian terhadap kontrol positif menunjukkan bahwa koloni yang tumbuh, baik pada media pengaya sampai uji identifikasi semuanya menunjukkan karakteristik Campylobacter jejuni. Dengan demikian pada 10 kontrol positif, Campylobacter jejuni semuanya dapat terisolasi kembali. Berdasarkan hasil pengujian tersebut maka dapat ditunjukkan bahwa validasi sekunder menghasilkan nilai recovery sebesar 70. Pertumbuhan Campylobacter jejuni sangat dipengaruhi oleh karakteristik daging ayam yang digunakan sebagai sampel. Karakteristik tersebut dapat mempercepat laju pertumbuhan Campylobacter jejuni tetapi dapat juga menghambat pertumbuhannya., antara lain : ketersediaan nutrisi, aktivitas air Aw, nilai pH, bahan anti mikroba dan potensial redoks. Selain itu, kontaminasi mikroba lain selama proses penanganan daging ayam juga dapat menghambat pertumbuhan Campylobacter jejuni. Faktor penghambat tersebut yang mungkin menyebabkan inokulum yang di-spike tidak dapat diisolasi kembali seluruhnya 100. Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa kultur Campylobacter jejuni pada kultur stok dengan sertifikat ATCC 33291, terkonfirmasi kemurniannya. Hasil isolasi terhadap sampel negatif menunjukkan bahwa dari 10 sampel yang diisolasi semuanya tidak terkontaminasi Campylobacter jejuni, sedangkan pada 7 dari 10 sampel positif, Campylobacter jejuni dapat terisolasi kembali, dan 3 sampel tidak terisolasi kembali, serta hasil isolasi pada 10 kontrol positif, Campylobacter jejuni semuanya terisolasi kembali sehingga hasil validasi sekunder metode analisa Campylobacter jejuni pada daging ayam berdasarkan metode analisa ISO 10272 2006 bagian 1 memberikan recovery sebesar 70 dengan limit deteksi 100 CFUgram, dan dapat diterapkan dalam pengujian laboratorium. Untuk melihat sensitivitas metode analisa Campylobacter jejuni, disarankan untuk melakukan penelitian lanjutan menggunakan parameter uji limit deteksi dengan jumlah spike dibawah 100 CFUml, validasi sekunder juga dilakukan terhadap metode analisa yang dikembangkan oleh organisasi lain seperti BAM. I. PENDAHULUAN A. LATAR BELAKANG Foodborne disease penyakit akibat pangan merupakan suatu penyakit yang diderita oleh seseorang akibat mengonsumsi makanan yang telah terkontaminasi bahan kimia beracun atau mikroba patogen. Salah satu gejala foodborne disease akibat kontaminasi mikroba patogen adalah diare. Salmonella spp, Shigella spp dan Campylobacter spp merupakan bakteri-bakteri patogen penyebab diare yang banyak diderita oleh masyarakat. Mikroorganisme tersebut paling banyak ditemukan pada bahan pangan mentah berupa daging unggas, telur, susu, ikan dan sayuran. Campylobacter jejuni merupakan salah satu bakteri patogen yang sering mengontaminasi bahan pangan. Bakteri ini dapat mengontaminasi bahan pangan melalui kotoran ternak, unggas yang terinfeksi, susu dari sapi yang terinfeksi, kontaminasi selama proses pengolahan dan air yang tercemar Stern dan Line 2000. Umumnya, manusia yang terinfeksi Campylobacter jejuni menderita gejala seperti sakit perut, demam kadang-kadang 40 C dan diare mirip disentri. Pada tinjanya dapat ditemukan darah segar, mucus dan leukosit. Periode inkubasi sekitar 2 – 7 hari dan penyakit biasanya berlangsung pada periode yang sama. Diare umumnya bersifat self-limiting sembuh tanpa pengobatan. Organisme ini dikeluarkan dalam feses tinja selama beberapa minggu Stern dan Line 2000. Menurut Skirrow dalam Doyle 1989, diketahui bahwa 50 dari pasien yang terinfeksi Campylobacter berumur 15 - 44 tahun, dan dari jumlah tersebut didominasi oleh anak-anak muda, selebihnya orang dewasa. Kasus penyakit diare akibat terinfeksi bakteri Campylobacter dibeberapa negara telah banyak dilaporkan, misalnya di Amerika Serikat dilaporkan sekitar 2,5 juta penderita campylobacteriosis dan 124 penderita meninggal dunia setiap tahunnya Hu dan Kopecko 2003. Pada tahun 1998 kasus infeksi Campylobacter juga dilaporkan di Belanda sebanyak 3.398 kasus, di Denmark sebanyak 3.372 kasus, di Spanyol sebanyak 4.382 kasus Schmidt dan Tirado 2001. The Swedish Institute for Infection Desease Control 2008 melaporkan bahwa pada tahun 2007 total 7.106 kasus campylobacteriosis terjadi di Swedia, dengan 77,45 kasus setiap 100.000 populasi. Sedangkan di Indonesia, dari 21.763 penderita diare sekitar 3,6 nya disebabkan karena Campylobacter jejuni Tjaniadi et al. 2003. Menurut Altekruse et al. 1999 Campylobacter jejuni dapat diisolasi dari hampir 98 karkas ayam yang diperiksa dengan jumlah bakteri melebihi 10 3 CFUg jaringan. Disamping itu, lebih dari 50 daging ayam mentah yang dijual dipasar Amerika Serikat terkontaminasi Campylobacter NCID 2005 dalam Abdy 2007. Di Indonesia dari 70 sampel yang pernah diteliti 11 15,7 terkontaminasi Campylobacter jejuni Adriani et al. 2006. Data tersebut belum cukup untuk memotret kondisi di Indonesia yang sangat luas. Dua alasan yang dapat dikemukakan terhadap kondisi tersebut adalah karena laboratorium yang melakukan pengujian terhadap Campylobacter jejuni belum banyak dengan metoda analisa yang valid dan daging ayam mungkin tidak terkontaminasi karena ketatnya persyaratan tumbuh dari bakteri tersebut sehingga kurang kompetitif dibandingkan bakteri lain. Untuk mengetahui kontaminasi bakteri Campylobacter jejuni pada daging ayam, maka harus dilakukan pengujian laboratorium. Saat ini banyak metode analisa baku dan resmi untuk menguji keberadaan Campylobacter jejuni yang dikembangkan oleh lembaga-lembaga di tingkat internasional. Sebelum digunakan metode-metode tersebut harus divalidasi terlebih dahulu. Validasi metode analisa adalah penilaian parameter analitik tertentu berdasarkan percobaan untuk memenuhi syarat sesuai tujuan penggunaan atau konfirmasi melalui pengujian dan bukti obyektif agar persyaratan untuk maksud khusus dipenuhi ISOIEC 17025-2005 dalam Udin 2007. Validasi diperlukan untuk mendapatkan hasil analisis yang absahvalid, dapat dipercaya, dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah dan kesesuaian dengan tujuan Sukarno 2005. Validasi dalam rangka pembuatan metode analisa disebut sebagai validasi primer. Validasi primer harus dilakukan jika metode analisis baru dikembangkan karena karakteristik unjuk kerja metodenya belum diketahui terkait dengan persyaratan dan penggunaannya serta jika metode analisis yang telah dikembangkan, dimodifikasi dan atau diterapkan pada matriksbentuk sediaan yang berbeda. Sedangkan untuk metode baku dan metode resmi yang akan diadopsi, tidak perlu dilakukan validasi primer tetapi cukup diverifikasi validasi sekunder. Validasi sekunderverifikasi metode analisa adalah proses konfirmasi kembali untuk menunjukkan metode sesuai dalam memenuhi kebutuhan laboratorium. Verifikasi diperlukan karena adanya perbedaan kondisi pengujian seperti kondisi lingkungan, personil, instrumen, pereaksi yang dipakai dalam metode baku atau metode resmi dengan laboratorium yang akan menggunakannya. Validasi metode analisa dapat dilakukan pada metode kuantitatif maupun kualitatif. Parameter untuk pengujian mikrobiologi pada validasi sekunder metode kualitatif adalah spesifisitas.

B. TUJUAN

1. Tujuan umum Penelitian ini bertujuan untuk melakukan verifikasivalidasi sekunder metode analisa Campylobacter jejuni sesuai ISO 10272 2006 bagian 1, sehingga dapat digunakan untuk analisis terhadap daging ayam di Indonesia. 2. Tujuan khusus Tujuan khusus dalam penelitian ini adalah a. Melakukan konfirmasi kemurnian Campylobacter jejuni yang akan digunakan dalam validasi sekunder. b. Melakukan validasi sekunder metode analisa kualitatif Campylobacter jejuni dengan parameter spesifisitas.

C. MANFAAT

Dengan dilakukan penelitian ini, diharapkan dapat diperoleh keabsahan validitas metode analisa Campylobacter jejuni pada daging ayam sehingga dapat diadopsi di Indonesia. II. TINJAUAN PUSTAKA A . CAMPYLOBACTER Campylobacter awalnya disebut Vibrio karena bentuknya yang bergelombang dan seperti spiral. Pada awal 1970, mikroba ini diklasifikasikan dalam genus Campylobacter Stern dan Line 2000. Enam belas spesies dan enam subspesies telah dikenal dalam Campylobacter, dua belas diantaranya merupakan penyebab penyakit pada manusia Tabel 1. Bakteri patogen ini dibagi kedalam dua kelompok yaitu penyebab penyakit diare dan penyebab infeksi intestinal. Penyebab penyakit diare diantaranya adalah Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter upsaliensis, Campylobacter lari dan Campylobacter fetus, sedangkan penyebab infeksi ekstraintestinal, termasuk Campylobacter fetus dan lain- lain Hu dan Kopecko 2003. Dari berbagai macam spesies Campylobacter, satu spesies yang paling sering dihubungkan dengan penyakit pada manusia adalah Campylobacter jejuni Banwart 1989. Tabel 1 Karakterisitik dari spesies Campylobacter Pertumbuhan C Kerentanan Spesies Kata lase Red uksi nit Rat H 2 S Hidr olisi s hipu rat Ure ase 25 37 42 Asam Nalidik Sat Cefa lotin Isi G+C mol C.fetus subsp. Fetus + + - - - + + - R S 33-34 C.fetus subsp. Venerealis + + - - - + + - R S 33-34 C.hyointestinalis + + + - - + + + R S 35-36 C. jejuni + + - + - - + + S R 30-32 C. coli + + - - - - + + S R 31-33 C. lari + + - - - - + + R R 31-33 C. upsaliensis - + - - - - + + S S 35-36 C. cinaedi + + - - - - + - S I 37-38 C. fennelliae + - - - - - + - S S 37-38 C. sputorum - + + - - - + + S S 31-32 Biovar sputorum Biovar bubulus - + + - - - + + R S 31-32 Biovar fecalis + + + - - - + + R S 32-33 C. mucosalis - + + - - - + + R S 38-39 C. concisus - + + - - - + + R R 38-39 Sumber : Bridson 1998 Keterangan : + : Reaksi positif R : Resisten - : Reaksi negatif S : Sensitif + : Banyak positif tetapi sedikit yang negatif I : Intermediet - : Banyak negatif tetapi sedikit yang positif Karakteristik morfologi dari genus Campylobacter yaitu sangat kecil lebar 0,2 sampai 0,5 μm dan panjang 0,5 sampai 5 μm , tidak membentuk spora, Gram