Media CBA pertama diinkubasi pada suhu 25 C selama 44 jam secara
mikroaerofilik + 4 jam dalam suasana mikroaerofilik dan digunakan untuk mengamati pertumbuhan 25
C. Media CBA kedua diinkubasi pada suhu 41,5
C selama 44 jam secara mikroaerofilik + 4 jam dalam suasana aerobik dan digunakan untuk mengamati pertumbuhan
41,5 C.
iii. Uji oksidase Koloni terpisah yang tumbuh pada media CBA dicuplik 1
sengkelit dan diinokulasikan pada kertas oksidase kertas filter yang dijenuhkan dengan pereaksi oksidase. Hasil positif apabila terjadi
perubahan warna dari ungu sampai dengan biru tua dalam 10 detik. Kontrol positif dan kontrol negatif juga dilakukan untuk konfirmasi,
apabila menggunakan kit test oksidase maka petunjuk penggunaannya diikuti. Interpretasi hasil seperti pada tabel 6.
Tabel 6 Karakteristik spesies Campylobacter Morfologi
Kecil dan batang melengkung Motilitas Karakteristik
Pertumbuhan pada 25 C mikroaerofilik
- negatif Pertumbuhan pada 41,5
C aerobik - negatif
Oksidase + positif
Sumber : ISO 2006
d. Identifikasi spesies Campylobacter Umumnya spesies Campylobacter tumbuh pada 41,5
C, dan yang paling sering adalah spesies Campylobacter jejuni dan Campylobacter coli.
Spesies lain juga tumbuh meskipun tidak spesifik seperti Campylobacter lari
, Campylobacter upsaliensis dan beberapa yang lain.
i. Pertumbuhan pada TSIA
Koloni spesifik yang tumbuh terpisah pada media selektif mCCDA dan Preston agar diambil 1 sengkelit dan digoreskan pada
permukaan media TSIA dan secara tegak ditusuk sampai dasar butt, kemudian diinkubasi pada 41,5
C selama 24 jam secara mikroaerofilik dan apabila perlu diperpanjang sampai 5 hari dalam suasana
mikroaerofilik. Jika pada butt terbentuk warna kuning menujukkan
hasil positif glukosa fermentasi glukosa, merah atau tidak berubah menunjukkan negatif glukosa tidak memfermentasi glukosa dan hitam
menunjukkan pembentukan H
2
S serta adanya gelembung atau retakan mengindikasikan pembentukan gas dari glukosa. Sedangkan pada slant
terbentuk warna kuning menunjukkan positif laktosa dan atau sukrosa
satu atau kedua gula digunakan, merah atau tidak berubah menunjukkan negatif laktosa dan sukrosa gula tidak digunakan.
ii. Uji Katalase
Koloni spesifik yang tumbuh pada media TSIA diambil 1 sengkelit dan diinokulasikan pada gelas preparat bersih. Selanjutnya
koloni tersebut diteteskan dengan 1 tetes larutan H
2
O
2
3. Hasil pengujian dikatakan positif apabila muncul gelembung-gelembung
setelah 30 detik.
iii. Uji terhadap asam nalidiksat dan cefalotin
Koloni spesifik yang tumbuh pada media selektif mCCDA dan Preston agar diambil beberapa sengkelit untuk disuspensikan ke dalam
media Brucella broth dengan kekeruhan 0,5 terhadap skala MacFarland. Untuk mendapatkan tingkat kekeruhan yang sesuai, dapat dilakukan
pengenceran suspensi dengan perbandingan 1 : 10 dengan media yang sama. Kemudian suspensi tersebut dituang dan diratakan di atas
permukaan lempeng media Mueller Hinton 5 blood agar. Untuk mengeringkan suspensi, dibiarkan 5 menit pada LAF, lalu pengeringan
dilanjutkan dalam oven 37 C selama 10 menit. Tahap berikutnya, diatas
permukaan media agar diletakkan cakram kertas yang mengandung asam nalidiksat 30
μg dan cakram kertas cefalotin 30 μg. Selanjutnya diinkubasi pada 37
C selama 24 jam secara mikroaerofilik dalam suasana mikroaerofilik. Interpretasi hasil: a adanya
pertumbuhan walaupun kontak dengan cakram kertas berarti resisten, b adanya daerah jernih di sekitar cakram kertas karena ada hambatan
pertumbuhan berarti sensitif.
iv. Uji hidrolisis hipurat
Koloni spesifik yang tumbuh pada media selektif mCCDA dan Preston agar diambil 1 sengkelit dengan hati-hati sehingga terbebas dari
agar media untuk diinokulasikan pada 0,4 ml larutan natrium hipurat dalam tabung hemolisis. Kemudian suspensi tersebut dikocok dengan
kuat dan diinkubasi pada 37 C selama 2 jam dalam tangas air atau 4
jam dalam inkubator. Selanjutnya ditambahkan 0,2 ml larutan ninhidrin dengan hati-hati ke atas permukaan larutan natrium hipurat. Tabung
tersebut tidak digoyang. Pengamatan hasil setelah inkubasi 37 C selama
10 menit dalam tangas air atau inkubator. Reaksi positif apabila warnanya menjadi ungu tua dan reaksi negatif apabila warna tidak
berubah sampai ungu muda. v. Uji hidrolisis indoksil asetat
Koloni spesifik yang tumbuh pada media selektif mCCDA dan Preston agar diambil 1 sengkelit untuk diinokulasikan pada kertas
indoksil asetat. Selanjutnya ditambahkan satu tetes aquades steril. Reaksi yang terjadi diamati. Jika terhidrolisis, maka terjadi perubahan
warna menjadi biru tua selama 5 – 10 menit. Jika tidak terjadi perubahan warna maka tidak terjadi hidrolisis.
Interpretasi hasil dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7 Karakteristik dari spesies Campylobacter Karakteristik
C jejuni C coli
C lari C upsaliensis
Katalase + +
+ -
atau sedikit
Asam nalidiksat S
a
S
a
RS
b
S Cefalotin R
R R
S Hidrolisis hipurat
+ -
- -
Hidrolisis indoksil asetat +
+ -
+ + = positif, - = negatif, S = sensitif, R = resisten
a = dapat menjadi resisten b = bisa sensitif dan bisa juga resisten
Sumber: ISO 2006
Prosedur identifikasi Campylobacter jejuni pada daging ayam secara lengkap dapat dilihat pada gambar 6.
1. Homogensiasi
2. Pengayaan
Digores 3. Isolasi
4. Konfirmasi Digores 5.
Identifikasi Gambar 6 Diagram alir prosedur kerja pengujian Campylobacter jejuni pada
daging ayam. 25 gram sampel dalam 225 ml
Bolton broth
mCCDA agar Inkubasi pada 41,5
C :24-48 jam secara mikroaerofilik
Inkubasi suhu 37 C – 4 jam
dan Inkubasi pada 41,5
C – 44 jam secara mikroaerofilik
Preston agar Inkubasi pada 41,5
C:24-48 jam secara mikroaerofilik
Morfologi dan motilitas
Uji hidrolisis hipurat
Pertumbuhan pada 25 C
dan 41,5 C
Uji terhadap asam nalidiksat dan
cefalotin Uji katalase
Uji oksidase Uji hidrolisis indoksil
asetat CBA pada 41,5
C:24-48 jam secara mikroaerofilik
Uji TSIA
E. ANALISIS DATA VALIDASI SEKUNDER