Pertumbuhan pada TSIA Isolasi Campylobacter jejuni pada daging ayam

Media CBA pertama diinkubasi pada suhu 25 C selama 44 jam secara mikroaerofilik + 4 jam dalam suasana mikroaerofilik dan digunakan untuk mengamati pertumbuhan 25 C. Media CBA kedua diinkubasi pada suhu 41,5 C selama 44 jam secara mikroaerofilik + 4 jam dalam suasana aerobik dan digunakan untuk mengamati pertumbuhan 41,5 C. iii. Uji oksidase Koloni terpisah yang tumbuh pada media CBA dicuplik 1 sengkelit dan diinokulasikan pada kertas oksidase kertas filter yang dijenuhkan dengan pereaksi oksidase. Hasil positif apabila terjadi perubahan warna dari ungu sampai dengan biru tua dalam 10 detik. Kontrol positif dan kontrol negatif juga dilakukan untuk konfirmasi, apabila menggunakan kit test oksidase maka petunjuk penggunaannya diikuti. Interpretasi hasil seperti pada tabel 6. Tabel 6 Karakteristik spesies Campylobacter Morfologi Kecil dan batang melengkung Motilitas Karakteristik Pertumbuhan pada 25 C mikroaerofilik - negatif Pertumbuhan pada 41,5 C aerobik - negatif Oksidase + positif Sumber : ISO 2006 d. Identifikasi spesies Campylobacter Umumnya spesies Campylobacter tumbuh pada 41,5 C, dan yang paling sering adalah spesies Campylobacter jejuni dan Campylobacter coli. Spesies lain juga tumbuh meskipun tidak spesifik seperti Campylobacter lari , Campylobacter upsaliensis dan beberapa yang lain.

i. Pertumbuhan pada TSIA

Koloni spesifik yang tumbuh terpisah pada media selektif mCCDA dan Preston agar diambil 1 sengkelit dan digoreskan pada permukaan media TSIA dan secara tegak ditusuk sampai dasar butt, kemudian diinkubasi pada 41,5 C selama 24 jam secara mikroaerofilik dan apabila perlu diperpanjang sampai 5 hari dalam suasana mikroaerofilik. Jika pada butt terbentuk warna kuning menujukkan hasil positif glukosa fermentasi glukosa, merah atau tidak berubah menunjukkan negatif glukosa tidak memfermentasi glukosa dan hitam menunjukkan pembentukan H 2 S serta adanya gelembung atau retakan mengindikasikan pembentukan gas dari glukosa. Sedangkan pada slant terbentuk warna kuning menunjukkan positif laktosa dan atau sukrosa satu atau kedua gula digunakan, merah atau tidak berubah menunjukkan negatif laktosa dan sukrosa gula tidak digunakan. ii. Uji Katalase Koloni spesifik yang tumbuh pada media TSIA diambil 1 sengkelit dan diinokulasikan pada gelas preparat bersih. Selanjutnya koloni tersebut diteteskan dengan 1 tetes larutan H 2 O 2 3. Hasil pengujian dikatakan positif apabila muncul gelembung-gelembung setelah 30 detik. iii. Uji terhadap asam nalidiksat dan cefalotin Koloni spesifik yang tumbuh pada media selektif mCCDA dan Preston agar diambil beberapa sengkelit untuk disuspensikan ke dalam media Brucella broth dengan kekeruhan 0,5 terhadap skala MacFarland. Untuk mendapatkan tingkat kekeruhan yang sesuai, dapat dilakukan pengenceran suspensi dengan perbandingan 1 : 10 dengan media yang sama. Kemudian suspensi tersebut dituang dan diratakan di atas permukaan lempeng media Mueller Hinton 5 blood agar. Untuk mengeringkan suspensi, dibiarkan 5 menit pada LAF, lalu pengeringan dilanjutkan dalam oven 37 C selama 10 menit. Tahap berikutnya, diatas permukaan media agar diletakkan cakram kertas yang mengandung asam nalidiksat 30 μg dan cakram kertas cefalotin 30 μg. Selanjutnya diinkubasi pada 37 C selama 24 jam secara mikroaerofilik dalam suasana mikroaerofilik. Interpretasi hasil: a adanya pertumbuhan walaupun kontak dengan cakram kertas berarti resisten, b adanya daerah jernih di sekitar cakram kertas karena ada hambatan pertumbuhan berarti sensitif. iv. Uji hidrolisis hipurat Koloni spesifik yang tumbuh pada media selektif mCCDA dan Preston agar diambil 1 sengkelit dengan hati-hati sehingga terbebas dari agar media untuk diinokulasikan pada 0,4 ml larutan natrium hipurat dalam tabung hemolisis. Kemudian suspensi tersebut dikocok dengan kuat dan diinkubasi pada 37 C selama 2 jam dalam tangas air atau 4 jam dalam inkubator. Selanjutnya ditambahkan 0,2 ml larutan ninhidrin dengan hati-hati ke atas permukaan larutan natrium hipurat. Tabung tersebut tidak digoyang. Pengamatan hasil setelah inkubasi 37 C selama 10 menit dalam tangas air atau inkubator. Reaksi positif apabila warnanya menjadi ungu tua dan reaksi negatif apabila warna tidak berubah sampai ungu muda. v. Uji hidrolisis indoksil asetat Koloni spesifik yang tumbuh pada media selektif mCCDA dan Preston agar diambil 1 sengkelit untuk diinokulasikan pada kertas indoksil asetat. Selanjutnya ditambahkan satu tetes aquades steril. Reaksi yang terjadi diamati. Jika terhidrolisis, maka terjadi perubahan warna menjadi biru tua selama 5 – 10 menit. Jika tidak terjadi perubahan warna maka tidak terjadi hidrolisis. Interpretasi hasil dapat dilihat pada Tabel 7. Tabel 7 Karakteristik dari spesies Campylobacter Karakteristik C jejuni C coli C lari C upsaliensis Katalase + + + - atau sedikit Asam nalidiksat S a S a RS b S Cefalotin R R R S Hidrolisis hipurat + - - - Hidrolisis indoksil asetat + + - + + = positif, - = negatif, S = sensitif, R = resisten a = dapat menjadi resisten b = bisa sensitif dan bisa juga resisten Sumber: ISO 2006 Prosedur identifikasi Campylobacter jejuni pada daging ayam secara lengkap dapat dilihat pada gambar 6. 1. Homogensiasi 2. Pengayaan Digores 3. Isolasi 4. Konfirmasi Digores 5. Identifikasi Gambar 6 Diagram alir prosedur kerja pengujian Campylobacter jejuni pada daging ayam. 25 gram sampel dalam 225 ml Bolton broth mCCDA agar Inkubasi pada 41,5 C :24-48 jam secara mikroaerofilik Inkubasi suhu 37 C – 4 jam dan Inkubasi pada 41,5 C – 44 jam secara mikroaerofilik Preston agar Inkubasi pada 41,5 C:24-48 jam secara mikroaerofilik Morfologi dan motilitas Uji hidrolisis hipurat Pertumbuhan pada 25 C dan 41,5 C Uji terhadap asam nalidiksat dan cefalotin Uji katalase Uji oksidase Uji hidrolisis indoksil asetat CBA pada 41,5 C:24-48 jam secara mikroaerofilik Uji TSIA

E. ANALISIS DATA VALIDASI SEKUNDER