Supernatan yang telah dipindahkan ke tube baru ditambahkan 500 µl isopropanol dingin dan 300 µl NaCl. Campuran ini disimpan dalam freezer selama
45 menit - 1 jam. Penyimpanan bertujuan untuk mengendapkan dan membentuk benang-benang nukleat yang akan menjadi DNA. Hasil pengendapan tersebut
disentrifugasi pada kecepatan 13,000 rpm selama 2 menit, kemudian cairan dalam tube dibuang. Pembuangan cairan dilakukan dengan hati-hati agar pellet DNA
yang mengendap tidak ikut terbuang. Hasil pengendapan berupa pellet DNA dicuci dengan menggunakan etanol 90 sebanyak 300 µl. Kemudian
disentrifugasi dan membuang cairan etanol. Proses ini dilakukan sebanyak dua kali dengan tujuan mendapatkan pellet DNA yang cukup murni. Pellet DNA yang
telah dicuci dikeringkan dalam desikator ± 15 menit. Posisi tube yang berisi pellet DNA dalam keadaan terbalik agar silikagel di dalam desikator dapat
menyerap cairan yang ada dalam tube. DNA yang telah kering ditambahkan buffer TE sebanyak 50 µl dengan tujuan untuk memekatkan dan melarutkan pellet
DNA. Pellet DNA yang telah ditambahkan buffer TE, disentil-sentil dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 13,000 rpm selama 2 menit. Karakteristik
pita DNA dapat diamati dengan melakukan elektroforesis menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar 1 bv. Hasil elektroforesis berupa gel yang
berisi DNA dilarutkan dalam larutan EtBr ± 15 menit. Kualitas DNA dapat dilihat di UV Transiluminator.
3.3.3.2 Seleksi Primer
Primer adalah rantai pendek DNA yang dihasilkan secara buatan biasanya terdiri antara 10
– 25 nukleotida. Finkeldey 2005. Sepasang primer yang sekuennya telah ditentukan untuk dapat menemukan sekuen target pada DNA
digunakan dalam PCR. Segmen DNA diantara kedua titik pertemuan primer akan diamplifikasi dalam reaksi PCR. Primer berfungsi sebagai titik awal sintesis oleh
enzim yang disebut DNA polymerase yang diperoleh dari bakteri Thermus aquaticus. Enzim ini juga biasa disebut Taq DNA polymerase. Enzim ini sesuai
untuk proses amplifikasi karena dapat bertahan pada suhu tinggi hingga 95
o
C meskipun suhu optimum bagi aktivitas enzim adalah 72
o
C. Setelah terjadi
annealing selanjutnya dilakukan perbanyakan fragmen DNA melalui proses ekstensi pada suhu 72
o
C. Dalam teknik RAPD, umumnya primer yang digunakan berupa
oligonukleotida yang memiliki panjang sebesar 10-mer yang dipilih secara acak dan minimum memiliki lima basa G dan C. Primer yang mempunyai panjang
kurang dari 9-mer dapat digunakan tetapi akan menghasilkan produk amplifikasi yang lebih sedikit dan diperlukan metode pewarnaan yang lebih sensitif untuk
mendeteksinya. Seleksi primer dilakukan untuk memperoleh primer-primer yang dapat
mengamplifikasi DNA, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan produk. Pada kegiatan ini dilakukan survei terhadap 23 primer, yaitu primer dari
golongan OPA, OPB, OPO, OPU dan OPY yang diproduksi oleh Operon Technology Tabel 4. Primer dari Golongan OPA memiliki kode primer A.5, A.7,
A.12, A.14 dan A.16. Primer dari golongan OPB memiliki kode primer B.3, B.8, B.9, B.13 dan B.20. Primer dari golongan OPO memiliki kode primer O.5, O.10,
O.13 dan O.16. Primer dari golongan OPU memiliki kode primer U.4, U.5, U.8 dan U.14. Primer dari golongan OPY memiliki kode primer Y.12, Y.13, Y.16,
Y.18 dan Y.20. Dari hasil seleksi hanya dipilih 5 primer yang polimorfik dengan pita yang jelas.
Tabel 4 Urutan basa nukleotida 23 primer Operon Technology
No. Primer
Urutan Basa No.
Primer Urutan Basa
1 OPA-05
5 AGGGGTCTTG 3 13
OPO-13 5 GTCAGAGTCC 3
2 OPA-07
5 GAAACGGGTG 3 14
OPO-16 5 TCGGCGGTTC 3
3 OPA-12
5 TCGGCGATAG 3 15
OPU-04 5’ ACCTTCGGAC 3
4 OPA-14
5 TCTGTGCTGG 3 16
OPU-05 5’ TTGGCGGCCT 3
5 OPA-16
5 AGCCAGCGAA 3 17
OPU-08 5’ GGCGAAGGTT 3
6 OPB-03
5 CATCCCCCTG 3 18
OPU-14 5’ TGGGTCCCTC 3
7 OPB-08
5 GTCCACACGG 3 19
OPY-12 5 AAGCCTGCGA 3
8 OPB-09
5 TGGGGGACTC 3 20
OPY-13 5 CACAGCGACA 3
9 OPB-13
5 TTCCCCCGCT 3 21
OPY-16 5 GGGCCAATGT 3
10 OPB-20
5 GGACCCTTAC 3 22
OPY-18 5 GTGGAGTCAG 3
11 OPO-05
5 CCCAGTCACT 3 23
OPY-20 5 AGCCGTGGAA 3
12 OPO-10
5 TCAGAGCGCC 3
3.3.3.3 PCR Polymerase Chain Reaction
