3.3.3.1 Ekstraksi DNA
Ekstraksi dan isolasi DNA pada tanaman Sengon Solomon secara umum dilakukan dengan prosedur yang sama dengan kegiatan ekstraksi untuk jenis-jenis
pohon kehutanan yang lain. Ektraksi DNA atau isolasi DNA, merupakan metode pemisahan DNA dari bahan-bahan yang tidak diperlukan Laboratorium
Silvikultur 2007. Bahan yang dianalisis berupa sampel daun Sengon Solomon sebanyak 10 helai digerus dengan 500 µl buffer ekstrak dan 100 µl PVP 1 di
dalam pestel yang bersih sampai daun halus merata. Fungsi buffer ekstrak dan PVP adalah mempercepat proses penghancuran. Hasil gerusan dipindahkan ke
dalam tube 2 ml dan di vortex agar homogen. Oleh karena penggerusan yang telah dilakukan tidak cukup untuk merusak jaringan atau sel, maka hasil gerusan
direbus dalam air panas atau disebut dengan inkubasi. Proses inkubasi dilakukan selama 45 menit-1 jam dalam water bath dan setiap 15 menit sekali dibolak-
balikkan. Suhu optimal yang digunakan dalam proses inkubasi berkisar antara 65
o
-70
o
C. Apabila proses inkubasi melebihi suhu optimal maka DNA yang ada dalam tube akan rusak. Jika proses inkubasi telah selesai maka tube diangkat dan
didinginkan ± 15 menit. Tube yang telah dingin ditambahkan chloroform sebanyak 500 µl, lalu di
sentrifuse pada kecepatan 13,000 rpm selama 2 menit. Proses sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan bahan-bahan kimia atau fase organik dari fase air
berupa supernatan Gambar 7. Yang digunakan untuk tahapan selanjutnya adalah fase air yang berisi benang-benang nukleat. Untuk itu fase air dipisahkan dari fase
organik dengan menggunakan mikro pipet lalu fase air dipindahkan ke dalam tube baru. Kegiatan di atas dilakukan sebanyak dua kali.
Gambar 7 Proses pemisahan supernatan.
Supernatan yang telah dipindahkan ke tube baru ditambahkan 500 µl isopropanol dingin dan 300 µl NaCl. Campuran ini disimpan dalam freezer selama
45 menit - 1 jam. Penyimpanan bertujuan untuk mengendapkan dan membentuk benang-benang nukleat yang akan menjadi DNA. Hasil pengendapan tersebut
disentrifugasi pada kecepatan 13,000 rpm selama 2 menit, kemudian cairan dalam tube dibuang. Pembuangan cairan dilakukan dengan hati-hati agar pellet DNA
yang mengendap tidak ikut terbuang. Hasil pengendapan berupa pellet DNA dicuci dengan menggunakan etanol 90 sebanyak 300 µl. Kemudian
disentrifugasi dan membuang cairan etanol. Proses ini dilakukan sebanyak dua kali dengan tujuan mendapatkan pellet DNA yang cukup murni. Pellet DNA yang
telah dicuci dikeringkan dalam desikator ± 15 menit. Posisi tube yang berisi pellet DNA dalam keadaan terbalik agar silikagel di dalam desikator dapat
menyerap cairan yang ada dalam tube. DNA yang telah kering ditambahkan buffer TE sebanyak 50 µl dengan tujuan untuk memekatkan dan melarutkan pellet
DNA. Pellet DNA yang telah ditambahkan buffer TE, disentil-sentil dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 13,000 rpm selama 2 menit. Karakteristik
pita DNA dapat diamati dengan melakukan elektroforesis menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar 1 bv. Hasil elektroforesis berupa gel yang
berisi DNA dilarutkan dalam larutan EtBr ± 15 menit. Kualitas DNA dapat dilihat di UV Transiluminator.
3.3.3.2 Seleksi Primer
Kategori