12
3.3 Validasi Metode Analisis
Validasi metode direkomendasikan untuk memastikan bahwa suatu metode dapat menghasilkan data yang akurat dan dapat dipercaya. Validasi dipergunakan untuk metode analisa
yang baru dibuat dan dikembangkan. Selain itu, validasi metode dilakukan jika terjadi perubahan kondisi antara kondisi analisis dan kondisi pada saat validasi metode terdahulu, atau terjadi perubahan
metode dari metode standar. Beberapa manfaat validasi metode analisis yaitu untuk mengevaluasi unjuk kerja suatu metode analisis, menjamin prosedur analisis, menjamin keakuratan dan kedapat
ulangan hasil prosedur analisis, dan mengurangi resiko penyimpangan yang mungkin timbul EURACHEM, 1998.
Validasi metode dilakukan dengan cara melakukan kecermatan accuracy, keseksamaan precision, selektifitas specificity, linearitas dan rentang, batas deteksi atau limit of detection LOD,
batas kuantitasi atau limit of quantitation LOQ, ketangguhan metode ruggedness, dan uji kekuatan robustness. Terdapat beberapa rujukan validasi metode seperti International Organization for
Standardization ISO, United State Pharmacopoeia USP, British Pharmacopoeia BP, Association of Official Analytical Chemistry AOAC, International Union of Pure and Applied Chemistry
IUPAC dan International Conference on Harmonizaton ICH. Penelitian ini mengacu pada petunjuk validasi metode dari AOAC meliputi kecermatan, keseksamaan, linearitas, batas deteksi dan
batas kuantitasi. Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit
yang sebenarnya. Kecermatan juga dinyatakan sebagai persen perolehan kembali recovery analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat bergantung kepada sebaran galat sistematik di
dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu, untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan
yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu dan pelaksanaannya yang cermat dan sesuai prosedur Harmita, 2004.
Akurasi dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi spiked3placebo recovery atau metode adisi standard addition method. Metode simulasi dilakukan dengan menambahkan
sejumlah analit bahan murni ke dalam plasebo semua campuran reagent yang digunakan minus analit, lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang
ditambahkan kadar yang sebenarnya. Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo, maka dapat dipakai metode adisi. Dalam metode adisi, sampel dianalisis untuk diketahui komposisi
awal analitnya, kemudian sampel ditambahkan sejumlah tertentu standar dan dianalisis kembali. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya hasil yang ditambahkan.
Hasil uji recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya, sehingga akan diketahui nilai analisis error sistematisnya. Analisis dilakukan pada
kondisi yang sama antara sampel dan sampel yang ditambahkan standar. Kesalahan sistematis adalah sama dengan minus kesalahan acak dan penyebab dari kesalahan ini tidaklah diketahui.
Uji keseksamaan atau presisi digunakan untuk mengevaluasi tingkat kedekatan antara hasil tes individu sampel tertentu sehingga diketahui kesalahan acak analisis Harmita, 2004. Uji
keseksamaan dapat berupa uji keterulangan repeatibility dan ketertiruan reproducibility. Uji keseksamaan tidak berhubungan dengan nilai benar atau tidaknya nilai tersebut. Ukuran keseksamaan
biasanya diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif koefisien variasi. Uji keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang
sama pada kondisi yang sama dan dalam interval waktu yang pendek. Keterulangan dilakukan dengan menggunakan sampel yang identik dari batch yang sama, sehingga dapat memberikan ukuran
13 keseksamaan pada kondisi yang normal. Sedangkan uji ketertiruan adalah keseksamaan metode yang
dikerjakan pada kondisi berbeda. Analisis dilakukan dalam laboratoriumlaboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap
sampelsampel yang diduga identik serta dari batch yang sama. Reproducibility dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan analis yang berbeda
Harmita, 2004. Linieritas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara
langsung atau dengan bantuan transformasi matematika yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah
ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima Harmita, 2004. Jika terdapat hubungan yang linear, hasil uji harus dievaluasi lebih lanjut secara
statistik dengan perhitungan garis regresi. Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y= a+ bx. Linieritas yang baik adalah persamaan yang
memiliki R
2
lebih dari 0,99. Dalam penentuan linieritas, direkomendasikan untuk menggunakan minimum lima konsentrasi EMA,1995.
Uji batas deteksi atau Limit of Detection LOD adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi dan memberikan respon yang signifikan oleh alat Harmita, 2004, tetapi
konsentrasi tersebut belum tentu dimiliki oleh sampel yang diujikan. Pengujian LOD dilakukan dengan 7 kali ulangan, kemudian dihitung standar deviasinya. LOD, dinyatakan oleh persamaan:
= + 3
keterangan: LOD : Limit of Detection atau batas deteksi
x : Ratarata hasil pembacaan blanko
SD : Standar deviasi
Uji batas kuantitasi atau Limit of Quantitation LOQ menurut Harmita 2004 adalah kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.
Harmita selanjutnya menyatakan bahwa prinsip uji LOQ pada metode yang menggunakan instrumen dilakukan dengan membuat sederet blanko contoh sebanyak 7 – 10 kali ulangan. LOQ dinyatakan
oleh persamaan: = 10
keterangan: LOQ : Limit of Quantitation atau batas kuantitasi
SD : Standar deviasi
Selektifitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu secara akurat dan presisi walaupun terdapat komponen lain yang mungkin ada dalam matriks
sampel Harmita, 2004. Selektifitas dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode terhadap sampel yang mengandung cemaran seperti hasil urai atau senyawa sejenis atau senyawa asing lainnya,
kemudian dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung cemaran. Ketangguhan metode ruggedness adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari
analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, dan hari yang berbeda. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai
tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara laboratorium dan antar analis.
14 Uji kekuatan robustness dilakukan untuk mengetahui pengaruh dari perubahan
metodologi yang kecil yang terjadi terus menerus. Uji kekuatan juga berfungsi untuk mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. Identifikasi sekurangkurangnya 3 faktor analisis yang
dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah.
3.4 Potensiometri
