Jenis Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Alat Bahan Pengambilan Sampel Prosedur Penelitian .1 Pembuatan Pelarut

16

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian deskriptif dengan metode spektrofotometri derivatif terhadap analisa campuran metampiron dan fenilbutazon dalam sediaan kapsul.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni sampai dengan September 2015 di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

3.3 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer UV- Visible dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 32, Personal Computer PC yang dilengkapi software UV Probe 2.42 UV-1800 Shimadzu, neraca analitik Mettler Toledo, kuvet, kertas saring, bola karet, spatula, alat-alat gelas dan alat-alat lainnya yang diperlukan dalam penyiapan sampel.

3.4 Bahan

Bahanyang digunakan adalah Etanol-HCl 0,1 N, fenilbutazon BPFI, metampiron BPFI sertifikat pengujian dapat dilihat pada Lampiran 27 dan 28 halaman 117 dan 118, Neo Antidorin® Kapsul PT Samphindo Kimia Farmasi Industri. 17

3.5 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, yaitu ditentukan atas dasar pertimbangan bahwa sampel yang terambil mempunyai karakteristik yang sama dengan yang diteliti Sudjana, 2005. Sampel yang digunakan yaitu yang mengandung metampiron 300 mg dan fenilbutazon 125 mg. Gambar sediaan dan daftar spesifikasi sediaan kapsul dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2 halaman 43 dan 44. 3.6 Prosedur Penelitian 3.6.1 Pembuatan Pelarut Diencerkan 8,5 mL HCl 37 dan diadkan sampai 1 liter dengan Etanol Ditjen, POM., 1995. Perhitungan pembuatan pereaksi dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 46. 3.6.2 Pembuatan Larutan Induk Baku dan Larutan Standar

3.6.2.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Metampiron

Ditimbang seksama 50 mg metampiron dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, dilarutkan dan diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 µgml LIB I. Diambil 5 ml dari LIB I kemudian di encerkan dengan pelarut di dalam labu ukur 25 ml untuk mendapatkan larutan dengan konsentrasi 100 µgml LIB II. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 47. 3.6.2.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Fenilbutazon Ditimbang seksama 50 mg fenilbutazon BPFI dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, dilarutkan dan diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda sehingga 18 diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 µgml LIB I. Diambil 5,0 ml dari LIB I kemudian diencerkan dengan pelarut di dalam labu ukur 25 ml untuk mendapatkan larutan dengan konsentrasi 100 µgml LIB II. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 48.

3.6.2.3 Pembuatan Larutan Standar Metampiron

Larutan standar dibuat dalam 5 labu tentukur 10 mL yang memiliki konsentrasi masing- masing 12 μgmL, 16 μgmL, 20 μgmL, 24 μgmL, dan 28 μgmL. Dipipet sebanyak 1,2 mL; 1,6 mL; 2,0 mL; 2,4 mL; dan 2,8 mL dari LIB II metampiron, kemudian dimasukkan ke dalam 5 labu tentukur 10 mL dan dicukupkan volumenya sampai garis tanda dengan pelarut Etanol-HCl 0,1 N. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 49.

3.6.2.4 Pembuatan Larutan Standar Fenilbutazon

Larutan standar dibuat dalam 5 labu tentukur 10 mL yang memiliki konsentrasi masing- masing 4 μgmL, 6 μgmL, 8 μgmL, 10 μgmL, dan 12 μgmL. Dipipet sebanyak 0,4 mL; 0,6 mL; 0,8 mL; 1,0 mL; dan 1,2 mL dari LIB II fenilbutazon, kemudian dimasukkan ke dalam 5 labu tentukur 10 mL dan dicukupkan volumenya sampai garis tanda dengan pelarut Etanol-HCl 0,1 N. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 50. 3.6.3 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum 3.6.3.1 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Metampiron Diambil sebanyak 1,6 mL dari LIB II metampiron konsentrasi = 100 μgmL kemudian dimasukan ke dalam labu tentukur 10 mL untuk diencerkan dengan pelarut Etanol-HCl 0,1 N hingga garis tanda, lalu dikocok sampai homogen untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi 16 μgmL. Diukur serapannya pada 19 panjang gelombang 200-400 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 49.

3.6.3.2 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Fenilbutazon

Diambil sebanyak 0,95 mL dari LIB IIfenilbutazon konsentrasi = 100 μgmL kemudian dimasukan ke dalam labu tentukur 10 mL untuk kemudian dilarutkan denganEtanol-HCl 0,1 N. Selanjutnya larutan diencerkan dengan pelarut yang sama hingga garis tanda, lalu dikocok sampai homogen untuk memperoleh larutan fenilbutazon dengan konsentrasi 9,5 μgmL. Diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 50. 3.6.4 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif 3.6.4.1 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif Metampiron Dibuat spektrum serapan tanpa diderivatkan dari larutan standar metampiron dengan konsentrasi 12 μgmL, 16 μgmL, 20 μgmL, 24 μgmL, dan 28 μgmL pada panjang gelombang 200-400 nm. Kemudian spektrum ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dengan Δλ = 2 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 47.

3.6.4.2 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif Fenilbutazon

Dibuat spektrum serapan tanpa diderivatkan dari larutan standar fenilbutazon dengan konsentrasi 4 μgmL, 6 μgmL, 8 μgmL, 10 μgmL, dan 12 μgmL pada panjang gelombang 200-400 nm. Kemudian spektrum ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat per tama dan kedua dengan Δλ = 2 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 48. . 20

3.6.5 Penentuan Zero Crossing

Penentuan zero crossing diperoleh dengan menumpangtindihkan spektrum serapan masing-masing derivat dalam berbagai konsentrasi larutan. Zero crossing masing-masing zat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki serapan nol pada berbagai konsentrasi.

3.6.6 Penentuan Panjang Gelombang Analisis

Dibuat larutan metampiron dengan konsentrasi 24 μgmL, larutan fenilbutazon dengan konsentrasi 10 μgmL, dan larutan campuran metampiron 24 μgmL dan fenilbutazon 10 μgmL. Kemudian ketiga larutan ini diukur serapannya pada panjang gelombang 200–400 nm.Selanjutnya ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dari masing-masing zat tunggal dan dari campuran metampiron dan fenilbutazon. Spektrum serapan derivat kedua dari larutan zat tunggal dan campuran keduanya ditumpangtindihkan. Panjang gelombang yang dipilih untuk menjadi panjang gelombang analisis adalah yang pada panjang gelombang tertentu, serapan tunggal salah satu senyawa nol sedangkan serapan tunggalsenyawa pasangannya dan campuran keduanya hampir sama atau persis sama,karena pada panjang gelombang tersebut dapat secara selektifmengukur serapan salah satu senyawa tanpa diganggu oleh serapan senyawa pasangannya. 3.6.7 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Spektrum Kalibrasi 3.6.7.1Pembuatan dan Penentuan Linearitas Spektrum Kalibrasi Metampiron Dibuat larutan standar metampiron dengan konsentrasi 12 μgmL,16 μgmL,20 μgmL,24 μgmL, dan 28 μgmL, kemudian diukur serapan derivat kedua Δλ = 2 nm pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dan nilai serapan sehingga diperoleh 21 persamaan regresi linear y = ax + b. Berdasarkan nilai serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan pula perhitungan limit deteksi limit of detection LOD dan limit kuantitasi limit of quantitation LOQ.Untuk menentukan batas deteksi LOD dan batas kuantitasi LOQ dapat digunakan rumus : �� = � ∑� − �� 2 � − 2 ��� = 3× �� ����� ��� = 10 × �� ����� Keterangan : SB = Simpangan baku LOD = Limit of Detection LOQ = Limit of Quantitation

3.6.7.2 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Spektrum Kalibrasi Fenilbutazon

Dibuat larutan standar fenilbutazon dengan konsentrasi 4 μgmL,6 μgmL,8 μgmL, 10 μgmL dan 12 μgmL, kemudian diukur serapan derivat kedua Δλ = 2 nm pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dan nilai serapan sehingga diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b. Berdasarkan nilai serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan perhitungan limit deteksi limit of detection LOD dan limit kuantitasi limit of quantitation LOQ. Perhitungan untuk menentukan LOD dan LOQ seperti rumus sebelumnya. 22

3.6.8 Penentuan Kadar Metampiron dan Fenilbutazon Dalam Sediaan Kapsul

Ditimbang 20 sampel sediaan kapsul X yang mengandung metampiron 300 mg dan fenilbutazon 125 mg kemudian digerus dalam lumpang sampai halus dan homogen. Selanjutnya ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan 50 mg metampiron, dihitung kesetaraan fenilbutazon yang terkandung didalamnya penimbangan serbuk dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan. Selanjutnya dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL, dan dilarutkan dengan Etanol-HCl 0,1 N dengan sonikator selama ±15 menit, kemudian dicukupkan dengan Etanol-HCl 0,1 N sampai garis tanda, dikocok sampai homogen. Larutan tersebut kemudian disaring, lebih kurang 10 mL filtrat pertama dibuang. Filtrat selanjutnya ditampung, kemudian dari filtrat ini dipipet sebanyak 0,24 mL, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL dan dicukupkan dengan Etanol-HCl 0,1 N sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan yang didalamnya terdapat metampiron konsentrasi 24 μgmL dan fenilbutazon konsentrasi 10 μgmL. Diukur serapan pada panjang gelombang 200 −400 nm, selanjutnya spektrum serapan ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat kedua dengan Δλ 2 nm pada panjang gelombang analisis metampiron dan fenilbutazon masing-masing 251,20 nm dan 222,60 nm. Bagan alir prosedur penelitian penentuan kadar metampiron dan fenilbutazon dapat dilihat pada lampiran 5 halaman 36-37.

3.6.9 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik

Data perhitungan kadar metampiron dan fenilbutazon dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji T Tabel distribusi t dapat dilihat pada Lampiran 26 halaman 87. 23 Menurut Rohman 2007, rumus yang digunakan untuk mencari standar deviasi adalah : SD = 1 - n X - Xi 2 ∑ Sedangkan menurut sudjana 2005, untuk mencari t hitung digunakan rumus: t hitung = n SD X Xi − Data diterima jika -t tabel t hitung t tabel pada interval kepercayaan 95 dengan nilai α = 0,05. Keterangan : SD = Standard deviation simpangan baku Xi = Kadar dalam satu perlakuan − X = Kadar rata-rata dalam satu sampel mg100g n = Jumlah perlakuan α = Tingkat kepercayaan Menurut Sudjana 2005, untuk menghitung kadar metampiron dan fenilbutazon sebenarnya dalam sampel secara statistik dapat digunakan rumus: µ = X ± [tα2, dk x SD √n ] Keterangan : SD = Standard deviation simpangan baku − X = Kadar rata-rata dalam satu sampel n = Jumlah perlakuan t = Harga t tabel sesuai dengan derajat kepercayaan 24 3.6.10 Uji Validasi 3.6.10.1 Uji Akurasi Uji akurasi dilakukan dengan metode penambahan bahan baku yaitu dengan membuat 3 konsentrasi analit sampel dengan rentang spesifik 80, 100, 120. Dimana pada masing-masing rentang spesifik digunakan 70 sampel dan 30 baku yang akan ditambahkan Harmita, 2004. Kemudian campuran sampel dan baku diukur serapannya pada panjang gelombang 200–400 nm, selanjutnya spektrum serapan ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat kedua dengan Δλ 2 nm pada panjang gelombang analisis metampiron dan fenilbutazon masing-masing 251,20 nm dan 222,60 nm. Menurut Harmita 2004, perhitungan persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus: perolehan kembali = C F − C A C A ∗ x 100 Keterangan: C F = Konsentrasi sampel setelah penambahan bahan baku C A = Konsentrasi sampel sebelum penambahan bahan baku C A = Jumlah baku yang ditambahkan

3.6.10.2 Uji Presisi

Presisi diukur sebagai simpangan baku relatif atau koefisien variasi. Presisi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang homogen. Nilai simpangan baku relatif yang memenuhi persyaratan menunjukkan adanya keseksamaan metode yang dilakukan Harmita, 2004. 25 Menurut Rohman 2007,simpangan baku relatif dapat dihitung dengan rumus berikut ini : RSD = �� � × 100 Keterangan : � = Kadar rata-rata sampel SD = Standard Deviation RSD = Relative Standar Deviation 26 nm . 200.00 250.00 300.00 350.00 400.00 Ab s. 1.30000 1.00000 0.50000 0.00000 -0.10000 27 Gambar 4.3 Spektrum tumpang tindih serapan maksimum metampiron konsentrasi 16 µgmL dan fenilbutazon konsentrasi 9,5 µgm Dari Gambar 4.3 dapat dilihat bahwa hasil tumpang tindih serapan metampiron dan fenilbutazon terdapat serapan yang berimpit. Berdasarkan hasil spektrum tumpang tindih serapan maksimum diatas maka tidak dapat dilakukan penetapan kadar masing-masing komponen maka dilakukan derivatisasi terhadap masing-masing komponen.

4.2 Penentuan Spektrum Serapan