35
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental meliputi penyiapan sampel, pemeriksaan karakterisasi simplisia, pembuatan
ekstrak, pembuatan nata de coco, pembuatan matriks nata, pemerangkapan ekstrak ke dalam nata de coco, pembuatan sediaan gel dan pengujian efek penyembuhan
luka pada kelinci.
3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat-alat yang digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat- alat gelas laboratorium, freeze dryer Modulyo, inkubator Gallenkamp, neraca analitik
Sartorius, neraca kasar Ohaus, oven listrik Fisher Scientific, penangas air Yenaco, pH indikator, rotary evaporator Buchi, RE 111, pH meter, penangas
air Yenaco,
3.1.2 Bahan-bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tumbuhan srikaya Annona reticulata L., air kelapa, akuades, asam asetat 25 , etanol 80, etanol
70, gula pasir, HPMC 4000, lidokain® injeksi, NaOH, nipagin, propilenglikol, stater Acetobacter xylinum dan urea.
3.2 Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan pada penelitian ini adalah kelinci dengan berat badan 1,5-2 kg. Hewan dikarantina dalam kandang yang sesuai sebelum dan
selama digunakan untuk uji luka sayat.
Universitas Sumatera Utara
36
3.3 Pengumpulan sampel, Identifikasi dan Pengolahan Sampel 3.3.1 Pengumpulan Sampel
Sampel yang digunakan adalah daun srikaya Annona reticulata L. yang masih segar, diperoleh dari Klumpang Kecamatan Hamparan Perak Deli Serdang.
Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain.
3.3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, Bogor. Hasil
identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 46 .
3.3.3 Pengolahan Sampel
Daun srikaya yang telah dikumpulkan sebanyak 4 kg, dicuci bersih dengan air mengalir, ditiriskan, dikeringkan di lemari pengering. Kemudian. daun
diserbuk dan disimpan di dalam wadah kering dan terlindung dari cahaya matahari.
3.4 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut
dalam asam, penetapan kadar sari larut dalam air dan penetapan kadar sari larut dalam etanol Depkes, 1989.
3.4.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap simplisia meliputi warna, bentuk, ukuran dan ketebalan. Gambar tumbuhan daun segar dapat dilihat pada
lampiran 2 halaman . Gambar simplisia dapat dilihat pada lampiran 3 halaman .
Universitas Sumatera Utara
37
3.4.2 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluen. Dimasukkan 200 ml toluen dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat,
lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluen dibiarkan mendingin selama 30 menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml.
Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen
mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap
detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan
mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai
dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. WHO, 1992. 3.4.3 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1
liter dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama
diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes,
1989.
Universitas Sumatera Utara
38
3.4.4 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 95 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan
sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang
larut dalam etanol 95 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan. 3.4.5 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah dihaluskan dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, lalu diratakan. Krus
dipijarkan pada suhu 600ºC sampai arang habis, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang
telah dikeringkan Depkes, 1989.
3.4.6 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam
asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu kemudian dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 600ºC sampai
bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan Depkes, 1989.
3.5 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Srikaya EES
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 80. Sebanyak 750 g serbuk kering daun srikaya dimasukkan dalam
Universitas Sumatera Utara
39
wadah kaca berwarna gelap kemudian dimaserasi dengan pelarut etanol 80 sampai seluruh serbuk terendam, ditutup dan disimpan pada suhu kamar selama 5
hari terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk, kemudian disaring sehingga didapat maserat. Ampas dimaserasi kembali dengan etanol 80 selama 2 hari
menggunakan prosedur yang sama. Seluruh maserat digabungkan dan diuapkan dengan bantuan alat rotary evaporator pada temperatur
± 40 C sampai diperoleh
ekstrak yang agak kental, kemudian dipekatkan dengan freeze dryer pada suhu -40
C selama ± 24 jam. Depkes, 1979. Bagan dapat dilihat pada lampiran 14
halaman 59.
3.6 Pembuatan Nata De Coco NDC 3.6.1 Pembuatan Bibit atau Stater
Sebanyak 2 liter air kelapa dibiarkan hingga kotorannya mengendap dan disaring menggunakan kain kasa. Air kelapa ditambahkan urea sebanyak 10 g dan
gula pasir 400 g direbus di atas api yang besar hingga mendidih. Selama perebusan, air kelapa diaduk. Setelah mendidih selama
± 15 menit, diangkat dan didinginkan kemudian ditambahkan asam cuka 25 hingga larutan ini memiliki
pH 4. Diaduk hingga larutan tercampur merata. Setelah dingin dimasukkan ke dalam wadah yang steril, ditambahkan biakan murni sebanyak 400 ml. Ditutup
wadah dengan aluminium foil yang steril. Disimpan di ruang inkubasi dan dibiarkan selama 1 minggu. Setelah 1 minggu, di permukaan media akan
terbentuk lapisan berwarna putih. Berarti stater sudah jadi dan siap digunakan Warisno, 2004.
Universitas Sumatera Utara
40
3.6.2 Pembuatan Nata De Coco
Sebanyak 1 liter air kelapa yang telah disaring dari pengotoran ditambahkan urea sebanyak 5 g dan gula pasir 100 g kemudian direbus di atas api
yang besar hingga mendidih. Selama perebusan air kelapa diaduk. Setelah mendidih selama
± 15 menit diangkat dan didinginkan. Setelah dingin ditambahkan asam cuka 25 hingga larutan ini memiliki pH 4. Masukkan larutan
ke dalam wadah yang telah disterilkan kemudian tambahkan biakan murni sebanyak 100 ml. Ditutup wadah dengan aluminium foil yang steril dan disimpan
di ruang inkubasi selama 2 minggu Warisno, 2004. Bagan dapat dilihat pada lampiran halaman .
3.7 Pembuatan Matriks Nata
Nata de coco dicuci dengan NaOH 0,2 N kemudian dibilas dengan akuades hingga bersih dan tiriskan. Nata de coco dipotong 2 x 3 x 1 cm kemudian
di freeze dryer sampai kering pada suhu -40
o
C selama ±24 jam. Kemudian nata ditimbang satu persatu.
3.8 Pemerangkapan ekstrak dalam matriks nata de coco
Masing-masing matriks nata de coco ditimbang kemudian direndam ke dalam larutan EES 0,25, EES 0,5 dan EES 0,75. Masing-masing dibiarkan
selama 24 jam untuk memperoleh hasil perendaman optimal. Kemudian matriks nata tersebut ditiriskan dan dikeringkan di freeze dryer selama ± 24 jam. Bagan
dapat dilihat pada lampiran 13 halaman 58. Gambar dapat dilihat pada lamiran halaman .
3.9 Pembuatan gel
Universitas Sumatera Utara
41
Pada pembuatan sediaan dengan konsentrasi ekstrak etanol daun srikaya EES adalah 0,25, 0,5 dan 0,75 sebagai basis gel digunakan HPMC 4000
yaitu dengan formula sebagai berikut:
HPMC 3,5
Propilenglikol 15 Metil paraben 0,18
Air suling sampai 100 m.f gel
Tabel 1. Formulasi sediaan gel ekstrak etanol daun srikaya.
Keterangan: Formula A: dasar gel EES; Formula B: gel EES 0,25;
Formula C: gel EES 0,5; Formula D: gel EES 0,75 Cara Pembuatan :
HPMC dikembangkan ke dalam air panas sebanyak 20 kali beratnya selama 15 menit. Setelah mengembang ditambahkan metil paraben yang telah
dilarutkan dalam propilenglikol. Dicukupkan dengan air suling dan digerus homogen hingga diperoleh dasar gel. Ekstrak digerus dalam lumpang dengan
menambahkan etanol beberapa tetes sampai larut, lalu ditambahkan dengan dasar No
Komposisi Formula g
A B
C D
1 HPMC 4000
3,5 3,5
3,5 3,5
2 Propilen glikol
15 15
15 15
3 Metil paraben
0,18 0,18
0,18 0,18
4 EES
- 0,25
0,5 0,75
5 Air suling ad
100 100
100 100
Universitas Sumatera Utara
42
gel dan diaduk hingga homogen Suardi, dkk., 2008. Bagan pembuatan dapat dilihat pada lampiran 15 halaman .
3.10 Penentuan Mutu Fisik Sediaan Gel