42
0,01-0,001 dari kekuatan estrogen alami Muflichatun, 2008;55. Mekanisme tersebut juga terjadi dalam penghambatan fitoestrogen terhadap siklus sel.
Fitoestrogen merupakan inhibitor bagi aromatase yang berperan dalam pembentukan estradiol Alif, Trisnani;2015:2.
Gambar 13. Bagan Kerangka Berpikir Pengaruh Fitoestrogen terhadap Ovarium
C. Hipotesis Pemberian ekstrak daun kenari Canarium indicum, L. mempengaruhi
perkembangan folikel ovarium tikus putih betina Rattus norvsgicus, L..
Daun Kenari Fitoestrogen Jenis :
Flavonoid Organ Reproduksi
Betina
Ovarium Estrogen
Berpengaruh terhadap
perkembangan folikel ovarium
434 4
BABBIIIB METODEBPENELITIANB
A. JenisBPenelitianB
Jenis penelitian ini adalah eksperimen satu faktor dengan pola acak lengkap. Dosis uji pendahuluan dilakukan untuk menentukan dosis uji
sesungguhnya. Dosis uji pendahuluan menggunakan 3 kelompok perlakuan dan 1 kali kontrol dengan masing-masing kelompok 3 ekor tikus putih. Pemberian
ekstrak daun kenari dengan volume 3 ml perhari sesuai dengan dosis sebagai berikut :
1. P0 : 0 mgekorhari
2. P1 : 100 mg ekor hari
3. P2 : 200 mg ekor hari
4. P3 : 300 mg ekor hari
Tabel 3. Rata-rata jumlah folikel ovarium uji pendahuluan
4
JumlahBFolikelB
4 P04
P14 P24
P34
FolikelBPrimerB
1,64 2,64
2,64 3,34
FolikelBSekunderB
2,64 3,04
4,04 4,34
FolikelBTersierB
6,04 7,04
8,64 8,04
FolikelBDeBeraffB
4,04 5,64
6,04 4,04
OvulasiB
1,34 2,34
2,64 2,04
CorpusBluteumB
5,64 7,04
8,64 8,34
FolikelBatresiaB
2,64 4,34
5,64 6,04
444 4
Gambar 14. Diagram Rata-rata jumlah folikel ovarium uji pendahuluan
B.BRancaneanBPenelitianB
Penelitian ini adalah penelitian eksperimen dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL. Dengan menggunakan 3 kelompok
perlakuan dan 1 kali kontrol dengan masing-masing kelompok 5 ekor tikus putih. Pemberian ekstrak daun kenari dengan volume 4 ml perhari sesuai
dengan dosis masing-masing perlakuan secara oral yang didasarkan pada hasil uji pendahuluan yaitu sebagai berikut :
P0 : 0 mg ekor hari
P1 : 200 mg ekor hari
P2 : 300 mg ekor hari
P3 : 400 mg ekor hari
C.BWaktuBdanBTempatBPenelitianB
1. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober - November 2016.
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
P04Kontrol P14100
P24200 P34300
Primer Sekunder
Tersier De4Graff
Ovulasi Corpus4
luteum Atresia
454 4
2. Tempat Penelitian a. Pembuatan ekstrak daun kenari dilakukan di Laboratorium Farmasi
Unit II UGM dengan teknik ekstrasi maserasi. b. Pemeliharaan tikus dilakukan di Unit Pengelolaan Hewan
Laboratorium Biologi FMIPA UNY. c. Pembuatan preparat histologik organ dilakukan di Laboratorium
Patologi FKH UGM. d. Pengamatan preparat histologik folikel ovarium dilakukan di
Laboratorium Mikroskopi Biologi FMIPA UNY.
D.BPopulasiBdanBSampelB
1. Populasi Tikus putih betina umur 2 bulan dengan berat badan 150-200gram.
2. Sampel 16 ekor tikus putih betina yang diberi pelakuan ekstrak daun kenari.
E.BVariabelBPenelitianB
1. Variabel bebas Ekstrak uji daun kenari dengan dosis perlakuan :
P0 : 0 mgekor hari
P1 : 200 mg ekorhari
P2 : 300 mg ekorhari
P3 : 400 mg ekorhari
464 4
2. Variabel Tergayut Struktur histologik perkembangan folikel ovarium yaitu jumlah folikel
primer, sekunder, tersier, de graaf, corpus luteum, atresia, dan ovulasi.
F.BAlatBdanBBahanBPenelitianB
1. Alat a. Kandang tikus
b. Temapat pakan dan minum tikus c. Alat suntik ukuran 5ml
d. Botol jam e. Botol flakon
f. Sarung tangan g. Sonde oral
h. Cotton buds i. Kertas label
2. Bahan a. Tikus betina umur ±2 bulan
b. Alkohol 70, 80 dan 90 absolute
c Pakan Tikus d. Formalin 10
e. Chlorofom f. Aquadesh
j. Mikroskop k. Bak parafin
l. Alat bedah m. Gelas preparat
n. Alat ekstrasi maserasi o. Alat tulis
p. Mikrotom q. Nampan
j. Garam fisiologis k. Serbuk gergaji
l. Daun kenari m. Xylol
n. Toluol o. Haematoxylin
p. Glyserin q. Etanol 96
474 4
g. Pewarna Eosin h. Parafin
i. Pewarna giemsa
484 4
G.BLanekahBPenelitianB
1. Tahap persiapan a. Menyiapkan 16 tikus putih betina umur ±2 bulan dengan berat 150-200
gram. b. Menyiapkan kandang tikus sebanyak 4 buah.
c. Menyiapkan daun kenari. d. Melakukan ekstrasi daun kenari dengan teknik maserasi di
Laboratorium Farmasi Unit II UGM. 2. Tahap pembuatan ekstrak daun kenari dengan teknik maserasi.
Daun kenari yang sudah kering dihancurkan menjadi bentuk serbuk, kemudian massa yang telah halus dimasukkan kedalam maserator
dan ditambahkan dengan etanol 96 sampai terdapat selapis cairan penyari hasil rendaman. Proses maserasi yang dilakukan dengan cara
perendaman dibiarkan selama 24 jam. Cairan hasil ekstrasi ditampung dan sisa ampas direndam kembali dengan etanol 96 dan dibiarkan selama 24
jam. Cairan hasil maserasi ditampung kembali dan dilakukan kembali maserasi pada sisa serbuk daun hingga didapat tiga cairan hasil maserasi.
Seluruh hasil maserasi tersebut dievaporasi menggunakan alat evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental yang terpisah dari pelarut etanolnya.
3. Aklimatisasi a. Menyiapkan 16 ekor tikus putih Rattus norvegicus, L. berumur ±2
bulan.
494 4
b. Menyiapkan 4 buah kandang dan memasukkan tikus putih secara acak sebanyak 4 ekor tikus kedalam masing-masing kandang.
c. Memberikan pakan dan minum tikus setiap hari. d. Membersihkan kandang 3 kali seminggu dengan mengganti alas
berupa serbuk gergaji. e. Tahap aklimatisasi berlangsung selama 7 hari di Unit Pengelolaan
Hewan Biologi. 4. Perhitungan dosis
a. Perhitungan Dosis Penentuan dosis perlakuan pada penelitian didasarkan pada hasil
uji pendahuluan, dimana pada uji pendahuluan terdiri dari 4 kelompok perlakuan. Satu kelompok kontrol 0 mg ekstrak daun kenari dan tiga
kelompok perlakuan, masing-masing 100mg, 200mg, 300mg ekstrak Berdasarkan hal uji pendahuluan, dosis yang berpengaruh
terhadap perkembangan folikel ovarium adalah pada dosis perlakuan P2 200mg. Berdasarkan besar dosis tersebut, pada penelitian ini
ditentukan 4 kelompok perlakuan, yaitu 1 kelompok kontrol 0 mg ekstrak daun kenari dan 3 kelompok perlakuan P1200mg, P2
300mg dan P3 400mg. Dari 1000 gram daun kenari dihasilkan 17,17 gram ekstrak daun
kenari. 1 gram berat kering =
,
= 0,017 gram Dalam 1 gram mengandung 0,017 gr ekstrak.
504 4
Dalam 15 gram ekstrak daun kenari mengandung flavonoid 2,624 gr Quersetinekuivalen
a. Perlakuan 200mgekorhari 0,2 gr X 4 Tikus X 21 hari = 16,8 gr
b. Perlakuan 300mgekorhari 0,3 gr X 4 Tikus X 21 hari = 25,2 gr
c. Perlakuan 400 mgekorhari 0,4 gr X 4 Tikus X 21 hari = 33,6 gr
5. Tahap pelaksanaan a. Pemberian ekstrak daun kenari
Ekstrak daun kenari diberikan secara oral pada tikus sesuai dosisnya selama 21 hari sebanyak 4 ml 2 ml pada pukul 9.00 dan pukul 15.00
WIB. b. Pemeliharaan dengan pemberian pakan pakan AD 2 secara rutin setelah
pemberiak ekstrak daun kenari. c. Pengambilan apus vagina dilakukan untuk mengetahui siklus estrus
pada awal saat tikus akan mendapat perlakuan dan sesudah tikus mendapatkan perlakuan. Adapun prosedur pembuatan apus vagina
adalah gelas obyek dibersihkan dengan alkohol 70. Cotton bud dicelupkan ke dalam NaCl fisiologis,kemudian dimasukkan kedalam
vagina tikus sedalam 1 cm. Kemudian diputar secara perlahan-lahan dan merata sehingga diperoleh jaringan mukosa vagina. Cotton bud
yang mengandung mukosa vagina selanjutnya dioleskan diatas gelas
514 4
obyek sambil diputar sehingga diperoleh olesan yang merata. Gelas obyek selanjutnya dikering anginkan kemudian difiksasi dengan
menggunakan methanol 70 selama 15 menit dan ditetesi dengan methilen blue selama 15 menit. Selanjutnya sediaan dicuci dengan air
mengalir dan dikering anginkan pada suhu kamar. Sediaan apus vagina selanjutnya diamati dibawah mikroskop. Penentuan fase siklus estrus
dilakukan berdasarkan keberadaan sel-sel epitel vagina dan jumlah kualitatif sel-sel epitelnya.
d. Melakukan pembedahan dan pembuatan preparat histologik ovarium pada tikus putih yang didalamnya mencakup perkembangan folikel.
e. Pembuatan preparat histologik Dilakukan pembedahan terhadap tikus putih pada hari ke-21 pada saat
fase estrus kemudian dibedah dan diambil organ ovariumnya direndam dalam formalin 10. Pemuatan preparat dilakukan di Laboratorium
Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan UGM dengan cara kerja sebagai berikut :
1 Tikus dimatikan terlebih dahulu dengan cara dibius dengan menggunakan kloroform.
2 Sectio pembedahan Pembedahan pada hewan yang telah mati untuk pengambilan organ
yang akan digunakan sebagai preparat yaitu ovarium tikus putih. 3 Labeling Pemberian label
Ovarium dimasukkan ke dalam botol flakon dan diberi label.
524 4
4 Fixation Ovarium yang telah diberi label kemudian langsung dimasukkan
kedalam fixative, agar tidak terjadi autolisis post mortal. Dalam hal ini fiksative yang digunakan adalah larutan formalin 10.
5 Dehydration Pengeringan Dehidrasi adalah mengganti molekul air dengan molekul alkohol
bertingkat dari konsentrasi rendah hingga absolute dengan waktu tertentu :
a Alkohol 70 3x30 menit b Alkohol 80 3x30 menit
c Alkohol 90 3x30 menit d Alkohol 96 2x30 menit
e Alkohol absolute, 1x30 menit 6 Clearing Penjernihan
Proses ini bertujuan untuk menghilangkan alkohol agar parafin dapat masuk kedalam jaringan. Dalam pembuatan preparat folikel ovarium
ini agen penjernihan yang digunakan adalah toluol, hal ini dimaksudkan agar preparat ini tetap lunak, walaupun lama berada
didalam zat ini namun preparat tidak mengalami kerusakan. 7 Paraffination Pemasukan parafin
Proses infiltrasi dilakukan didalam oven incubator dengan temperatur 70-80ºc. Hal ini dimaksudkan agar temperaturnya cocok
untuk pengisian parafin selama proses ini agar jaringan tidak rusak.
534 4
Paraffin yang dipilih untuk pembuatan preparat ini adalah paraffin yang mempunyai titik leleh yang tidak terlalu merubah keadaan
sitologik dan sitokimianya. Proses ini dilakukan dengan memakai paraffin bertingkat, yaitu paraffin : toluol dengan perbandingan 1 : 1,
paraffin murni 1, paraffin murni 2, paraffin murni 3 masing-masing selama 30 menit. Pengisian paraffin tergantung dari tebal tipisnya
pEmotongan preparat yang digunakan.paraffin dibiarkan hingga memadat, serta blok diberi label arah pemotongan dan nama
jaringan. 8 Sectioning Pemotongan Dengan Mikrotom
a Blok paraffin yang berisi jaringan tadi diiris dengan scalpel, sehingga bagian yang akan diiris dengan pisau mikrotom
berbentuk segiempat teratur. Diiris sedemikian rupa sehingga preparat terletak pada bagian tengah caupes irisan tengah pita
preparat kira-kira 3-5 mm dari tepinya. b Blok paraffin diletakkan pada holder kayu dengan mencairkan
sedikit paraffin pada holder agar dapat melekat. c Lalu holder dengan blok paraffin dipasang pada rotary mikrotom
yang direkatkan. d Setelah dipasang pada holder,dipersiapkan tempat coupes pita
preparat dan kaus kecil untuk mengambil coupes dari pisau mikrotom.
544 4
e Jika sudah lengkap persiapannya, pisau mikrotom dipasang pada tempatnya dimikrotom dan direkatkan.
f Diatur tebal tipisnya coupes, pada preparat ini diatur 6 mikron. g Setelah diiris segera ditempelkan pada gelas benda pada proses
affixing 9 Affixing
a Sejumlah coupes diletakkan pada kaca benda yang telah diberi perekat dengan albumin, lalu ditetesi aquadest secukupnya.
b Kaca-kaca kemudian dipindahkan diatas hotplate yang panas 40- 45ºc, letak coupes diatur dan paraffinya direntangkan, kelebihan
air dihisap menggunakan pipet. c Kaca benda dibiarkan diatas hotplate sampai kering ±1 hari.
10 Pewarnaan hematoxylin eosin Langkah pertama adalah melakukan deparafinnasi dengan
mencelupkan kaca benda yang telah ditempeli coupes ke dalam xylol selama 30 menit. Selanjutnya melakukan proses pewarnaan
menggunakan Hematoxylyn-Eosin. a Setelah proses penghilangan parrafin, coupes dikeringkan dari
xylol mengguanakan kertas filter maupun tissue, selanjutnya melakukan rehidrasi berturut-turut dengan mencelupkan ke
dalam alkohol absolute, alkohol 96, 90, 80, 70 kemudian memasukkan dalam eosin selama 2 menit,
mencelupkan ke dalam alkohol 60, 50, 40, 30, 20
554 4
kemudian dicelupkan ke dalam Hematoxylyn selama 10 menit dan mencucinya menggunakan air mengalir.
b Menetesi slide dengan Canada Balsam. 11 Penutup
Setelah ditetesi mengguanakan Canada Balsam kemudian objek gelas ditutup dengan gelas penutup dan diusahakan tidak
muncul gelembung, karena adanya gelembung akan mengganggu pengamatan.
12 Pengamatan struktur histologik Preparat histologik uterus yang telah dibuat diamati
menggunakan mikroskop dengan perbesaran 40X. Preparat diamati seluruh bidang pandangnya, kemudian membandingkan hasil yang
diperoleh antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Cara menghitung jumlah folikel ovarium adalah dengan
mengamati preparat ovarium di bawah mikroskop, kemudian menghitung jumlah keseluruhan folikel ovarium yang terdapat di
lapisan ovarium tersebut. Jumlah keseluruhan folikel ovarium tersebut meliputi folikel primer, folikel sekunder, folikel tersier,
folikel de graff, ovulasi, corpus luteum dan folikel atresia.
564 4
H. TeknikBSamplineB
