III. METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kultur Bacillus thuringiensis
subsp. israelensis yang diperoleh dengan membiakkan campuran spora kristal produk komersial Vectobac pada medium agar miring Nutrien
Agar. Media yang digunakan adalah onggok tapioka sebagai sumber karbon, dan urea sebagai sumber nitrogen. Mineral trace element yang digunakan adalah
MgSO
4
.7H
2
O, ZnSO
4
.7H
2
O, FeSO
4
.7H
2
O, MnSO
4
.7H
2
O, CaCO
3
, K
2
HPO
4
, KH
2
PO
4
. bahan-bahan yang digunakan untuk analisa adalah nutrien agar NA, nutrien broth NB, NaOH, fenol 5, H
2
SO
4
pekat, garam fisiologis, air suling, etanol 70 dan spiritus. Larva nyamuk Aedes aegypti digunakan untuk pengujian
aktivitas bioinsektisida potensi produk yang telurnya diperoleh dari Laboratorium Entomologi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB.
Gambar 5. Larva nyamuk Aedes aegypti instar 3 Peralatan utama yang digunakan adalah rotary shaking incubator. Alat-
alat yang digunakan untuk analisa adalah otoklaf, inkubator, labu erlenmeyer, pemanas listrik, magnetic stirrer, pH-meter, sentrifuse, tabung film, tabung ulir,
tabung reaksi, eppendorf, pipet mekanik, jarum ose, lemari pendingin, oven, tanur, spektrofotometer, cawan petri, neraca analitik, cawan porselin, cawan
aluminium, vortex, desikator, serta alat gelas lainnya.
Satu lup biakan Bti
Inokulasi dalam 50 ml medium NB labu pembibitan I Inkubasi dalam rotary shaking incubator, 200 rpm, 30
o
C, 12 jam Kultur digunakan untuk menginokulasi labu pembibitan II
5 dari volume media kedua Inokulasi pada kondisi yang sama selama 12 jam
B. METODE PENELITIAN
1. Persiapan Media Kultivasi
a. Analisa Bahan Baku
Analisa ini bertujuan untuk mengetahui komposisi awal media yang digunakan, yaitu media sumber karbon dan nitrogen. Analisa komposisi media
sumber karbon dan nitrogen meliputi analisa kadar air, kadar abu, kadar protein dan kadar gula total.
b. Persiapan Inokulum
Inokulum kultur bibit kultivasi disiapkan secara bertahap mengikuti metode Vandekar dan Dulmage 1982. Diagram alir persiapan inokulum
disajikan pada Gambar 6.
Gambar 6. Diagram Alir Persiapan Inokulum Vandekar dan Dulmage, 1982
c. Pembuatan Media Kultivasi
Susunan media kultivasi yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 5 dan perhitungan perbandingan nilan CN dapat dilihat
Onggok + CaCO3 dalam buffer phospat
Urea + trace element dalam buffer phospat
Sterilisasi pada temperatur 121
o
C selama 15 menit
Dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer 500 ml secara aseptik pada Lampiran 1. Eksperimen dengan susunan media kultivasi tersebut
dilakukan dengan dua kali ulangan. Tabel 5. Susunan Media Kultivasi
Komposisi No
Formula C
N Onggok gL
Urea gL 1
A1B 3
1 7,69
2,66 2
A2B 5
1 13,80
2,66 3
A3B 7
1 20,00
2,66 4
A4B 9
1 26,31
2,66 5
A5B 11
1 32,70
2,66
Jenis dan jumlah mineral sesuai dengan yang digunakan oleh Dulmage dan Rhodes 1971, yaitu 0.3 gl MgSO
4
.7H
2
O, 0.02 gl FeSO
4
. 7H
2
O, 0.02 gl ZnSO
4
.7H
2
O, 0.02 gl MnSO
4
.7H
2
O dan 1.0 gl CaCO
3
. Media kultivasi tersebut dilarutkan ke dalam larutan buffer phosfat pH medium diatur sampai
nilai 7.2 dan suspensi onggok digelatinisasi sebelum disterilisasi.
Gambar 7. Diagram Alir Proses Persiapan Media Kultivasi
2. Kultivasi
Kultivasi dilakukan dalam beberapa labu erlenmeyer 500 ml yang masing- masing berisi 150 ml media kultivasi, dengan konsentrasi sumber karbon dan
nitrogen yang sesuai dengan perlakuan yang dicobakan Tabel 5. Masing-masing labu erlenmeyer diinokulasi dengan kultur inokulum dari labu pembibitan kedua
Labu Erlenmeyer 500 ml berisi medium kultivasi 150 ml steril
Inokulasi dengan inokulum dari labu pembibitan II 10 persen dari volume medium fermentasi
Inkubasi pada rotary shaking incubator, 30
o
C, 200 rpm, selama 72 jam Biakan diamati pada interval waktu tertentu
sebanyak 10 secara aseptik. Labu kultivasi diinkubasikan dalam rotary shaking incubator
pada 200 rpm dan suhu 30 °C selama 72 jam. Selama inkubasi, biakan diamati pada interval waktu tertentu
Kultivasi B. thuringiensis dilakukan secara curah dengan kondisi kultivasi sebagai berikut : kultivasi dilakukan pada labu kocok pada suhu 28-32 °C, pH
awal medium diatur sekitar 6,8-7,2, volume medium sekitar 12-23 dari kapasitas volume erlenmeyer, agitasi 142-340 rpm dan dipanen pada waktu inkubasi 24-48
jam Vandekar dan Dulmage, 1982, Mummigatti dan Raghunathan, 1990. Diagram alir kultivasi dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8. Diagram Alir Proses Kultivasi Vandekar dan Dulmage, 1982 Pengambilan contoh sampling dilakukan sebanyak 9 kali dengan volume
8 ml untuk setiap samplingnya. Sampling dilakukan pada waktu inkubasi jam ke- 0, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60 dan jam ke- 72.
Penentuan aktivitas insektisida mikroba dilakukan dengan cara menguji produk bioinsektisida atau kompleks spora kristal hasil fermentasi untuk semua
jenis perlakuan, dengan menentukan toksisitasnya terhadap larva nyamuk yang dinyatakan dalam LC
50
. Diagram alir penentuan aktifitas insektisida mikroba dapat dilihat pada Lampiran 4.
Setiap perlakuan diulang dua kali. Mortalitas larva diamati setiap hari sampai hari keempat. Campuran spora B. thuringiensis yang memberikan persen
mortalitas yang paling tinggi ditentukan nilai LC
50
-nya dengan menggunakan analisis probit program Quant software Steve Maud, University of Wales, College
of Cardiff, Inggris.
3. Analisa Parameter
Analisa parameter dalam penelitian meliputi analisa pendahuluan pra kultivasi, analisa kultivasi dan analisa pasca kultivasi.
Analisa pendahuluan meliputi penentuan kadar protein kadar gula total, kadar air dari media yang digunakan. Metode masing-masing penentuan kadar
dapat dilihat pada Lampiran 2. Data analisis yang dikumpulkan selama proses kultivasi yaitu :
a pH cairan kultivasi
b Pertumbuhan sel dengan menggunakan metode bobot kering
biomassa c
Kadar gula sisa dengan menggunakan metode fenol d
Pembentukan spora dengan menentukan jumlah spora hidup viable spore count VSC
Langkah-langkah pengerjaan analisis selama kultivasi ini dapat dilihat pada Lampiran 3.
Data-data yang diperoleh dari analisis selama kultivasi digunakan untuk menentukan parameter kinetika fermentasi. Parameter kinetika fermentasi yang
ditentukan meliputi laju pertumbuhan spesifik maksimum µ
x
-max, waktu ganda sel td
x
, efisiensi penggunaan substrat, konversi substrat menjadi biomassa Yxs dan konversi substrat menjadi produk Yps serta konversi biomassa menjadi
produk Ypx. Analisis pasca kultivasi meliputi penentuan jumlah spora hidup yang
terkandung dalam produk bioinsektisida atau campuran spora-kristal hasil kultivasi dan pengujian toksisitasnya terhadap larva Aedes aegypti yang
dinyatakan dalam LC
50
dengan metode bioassay. LC
50
dapat ditentukan dengan menggunakan analisis probit program Probit Quant software dari Steve Maund,
University of Wales, College of Cardiff, Inggris. Langkah-langkah pengerjaan analisis pasca kultivasi ini dapat dilihat pada Lampiran 4.
C. RANCANGAN PERCOBAAN
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap satu faktor. Faktor yang dipakai adalah kadar onggok yang terdiri dari 5 taraf. Dengan
demikian terdapat 5 unit perlakuan dengan dua kali ulangan. Model yang digunakan untuk disain ini adalah
Y
ij
= + A
i
+
ji
Dengan i = 1, 2, 3 ,4, 5. j = 1,2
Dimana : Y
ij
= Variabel respon dari hasil obsevasi ke-j yang terjadi karena perlakuan ke i.
= Rata-rata yang sebenarnya A
i
= Efek pelakuan ke-i.
ij
= Efek unit eksperimen ke-j yang terjadi karena perlakuan ke-i. Data yang diperoleh dari pengukuran parameter, masing-masing dianalisis
menggunakan analisa ragam uji F. Apabila hasilnya menunjukkan perbedaan yang nyata, analisis akan dilanjutkan dengan uji Duncan. Analisa ragam uji F tersebut
dilakukan menngunakan sofware SPSS.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. ANALISA BAHAN BAKU
Salah satu keberhasilan memproduksi bioinsektisida Bacillus thuringiensis adalah pengembangan media kultivasi. Banyak media yang digunakan berasal dari
bahan-bahan yang tersedia di alam sebagai sumber karbon, nitrogen dan mineral. Onggok tapioka dan urea merupakan media yang digunakan dalam penelitian ini.
Onggok dan urea terlebih dahulu diketahui komposisi karbon, nitrogen, kandungan air, dan mineral sebelum digunakan sebagai media kultivasi. Adapun
metode yang dilakukan untuk menganalisis komposisi karbon dan nitrogen media alam ini adalah dengan menggunakan alat kromatografi. Tabel 6 di bawah ini
memperlihatkan komposisi kandungan karbon dan nitrogen onggok dan urea. Tabel 6
. Kadar karbon, kadar nitrogen, kadar abu dan kadar air dari
onggok tapioka yang digunakan
Kadar persen Komponen
Onggok tapioka
Urea
Karbon C 40,43
20,00 Nitrogen N
0,143 45,20
Abu 0,87
- Air
2,11 -
Onggok tapioka merupakan limbah yang dihasilkan dari pengolahan ubi kayu menjadi tapioka, yang merupakan limbah padat utama setelah pengepresan.
Onggok digunakan sebagai media pertumbuhan Bacillus thuringiensis var. israelensis Bti
dalam produksi bioinsektisida karena onggok mengandung pati sekitar 60-70 berat kering Abbas et al. dalam Winarno, 1985. Onggok juga
dapat digunakan sebagai substrat untuk produksi selulase, amilase, amiloglukosidase dan angkak Jenie dan Fachda, 1991. Komposisi kimia onggok
dapat dilihat pada Tabel 7.