19
3.2 Penyiapan Sampel 3.2.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kelapa sawit yang diambil dariPT. Perkebunan Nusantara II Jalan Pasar 13 Km. 10 Tanjung
Morawa Kabupaten DeliSerdang, Sumatera Utara. Pengambilan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan sampel yang sama dari daerah lain
Bate’e, 2014.
3.2.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Laboratorium Herbarium Medanense, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Sumatera Utara Bate’e, 2014.
3.2.3 Pengolahan bahan tumbuhan
Pengolahan daun kelapa sawit dilakukan terhadap daun yang dewasa berwarna hijau, yaitu daun dipisahkan dari tulang daunnya sehingga yang dipakai
yaitu helai daunnya, dicuci bersih, ditiriskan, ditimbang, lalu dikeringkan di dalam lemari pengering pada suhu 40 – 50°C.selanjutnya sampel dihaluskan atau
diserbukan menggunakan blender, dimasukkan kedalam wadah plastik yang tertutup rapat dan disimpan di dalam suhu kamar.
3.3 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Kelapa Sawit
Serbuk simplisia diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol. Sebanyak 1,2 kg serbuk simplisia dimasukkan kedalam suatu bejana,
dituangi dengan 9 L 75 bagian etanol, ditutup. dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk lalu disaring. Ampas dicuci dengan
20 pelarut etanol secukupnya hingga diperoleh 3 L 100 bagian.Pindahkan maserat
ke dalam bejana tertutup, dibiarkan ditempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari, enap tuangkan Depkes RI, 1979.Pemekatan ekstrak dilakukan dengan alat
rotary evaporator pada suhu40 – 50
o
C hingga diperoleh ekstrak kental, selanjutnya defreeze dryer pada suhu -40
o
C hingga diperoleh ekstrak kering.
3.4 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak Etanol Daun Kelapa
Sawit
Pemeriksaan karakterisasi simplisiadan ekstrak meliputipenetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut
dalam etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam.
3.4.1 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluena. Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu
alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume
air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu yang berisi toluen jenuh tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah
ditimbang seksama, dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian
air tersuling, kemudian naikkan kecepatan penyulingan hingga 4 tetes tiap detik.Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dibilas dengan
toluen.Penyulingan dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima
21 dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah
sempurna, volume dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa
WHO, 1998.
3.4.2 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu
bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai
kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai diperoleh bobot tetap.Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.4.3 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18 jam.Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol.Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara.Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai diperoleh bobot tetap.Kadar sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.4.4 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan.Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, didinginkan dan
22 ditimbang sampai diperoleh bobot tetap.Kadar abu dihitung terhadap bahan yang
telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.4.5 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.4.6 Pemeriksaankarakterisasi ekstrak etanol daun kelapa sawit
Penetapan kadar ekstrak dilakukan sama seperti penetapan kadar serbuk simplisia ekstrak etanol daun kelapa sawit.
3.5 Pengujian Efek Toksisitas Subkronik
Pengujian toksisitas dilakukan berdasarkan pada pedoman uji toksisitas nonklinik secara in vivo BPOM RI, 2011.Hewan yang digunakan adalah mencit
jantan berumur 6 – 8 minggu sebanyak 30 ekor yang didapat dari laboratorium farmakologi fakultas farmasi Universitas Sumatera Utara.Sebelum percobaan
dimulai, hewan diaklimatisasi di ruang percobaan selama 7 – 14 hari.Hewan dikelompokkan secara acak sedemikian rupa sehingga penyebaran berat badan
merata untuk semua kelompok dengan variasi berat badan tidak lebih 20 dari rata-rata berat badan. Hewan dikelompokkan dalam enam kelompok, masing-
masing terdiri dari lima ekor mencit: Kelompok I
: Diberi suspensi Na-CMC 0,5 bv dosis 1 BB kelompok kontrol
23 Kelompok II : Diberi ekstrak etanol daun kelapa sawit dosis 500 mgkg BB
kelompok uji I Kelompok III : Diberi ekstrak etanol daun kelapa sawit dosis 1000 mgkg BB
kelompok uji II Kelompok IV : Diberi ekstrak etanol daun kelapa sawit dosis 2000 mgkg BB
kelompok uji III Kelompok V : Diberi suspensi Na-CMC 0,5 bv dosis 1 BB
kelompok satelit kontrol Kelompok VI : Diberi ekstrak etanol daun kelapa sawit dosis 2000 mgkg BB
Kelompok satelit dosis tinggi Sediaan uji diberikan secara oral setiap hari selama 28 hari. Kemudian
dilakukan pengamatan hewan uji terhadap gejala toksik yang muncul, untuk kelompok uji pengamatan dilakukan setiap hari selama 28 hari. Sedangkan untuk
kelompok satelit pengamatan dilanjutkan selama 14 hari untuk mendeteksi proses penyembuhan kembali dari pengaruh toksik. Hewan ditimbang setiap hari selama
28 hari untuk menentukan volume sediaan ujiyang akan diberikan.Perubahan berat badan dianalisis seminggu sekali. Pada akhir penelitian, hewan yang masih
hidup ditimbang dan diotopsi OECD, 2008. Pengamatan terjadinya gejala-gejala toksik dan gejala klinis yang berupa
perilaku fisik seperti diare, salivasi, lemas, gerak-gerik aneh seperti berjalan mundur dan menggunakan perut, hewan uji diletakkan diatas bidang yang datar
dilakukan pengamatan secara umum pada masing-masing kelompok selama 2 jam setelah 1 jam pemberian sediaan uji. Sedangkan jumlah makanan dan
minuman yang dikonsumsi ditimbang setiap 1 minggu sekali BPOM RI, 2011.
24
3.5.1 Pemeriksaan fungsi hati
Pemeriksaan fungsi hati dilakukan dengan menghitung kadar ALT
Alanin Aminotransferase
menggunakan alat spektrofotometer UV yang dikerjakanoleh laboratorium kesehatan daerah provinsi Sumatera Utara.
Darah diambil dari jantung sebanyak 0,5 ml darah dimasukkan kedalam microtube, didiamkan 5 menit, disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan
3000 rpm hingga dihasilkan serum yang bening. Penetapan kadar ALT dengan cara sejumlah 100 µl serum uji direaksikan dengan 1000 µl pereaksi uji untuk
pemeriksaan ALT dalam tabung reaksi 5 ml, dihomogenkan dengan bantuan vortex. Absorbansi diukur dengan spektrofotometer UV pada suhu 37°C tepat
setelah menit ke 1, 2, dan 3 pada panjang gelombang 340 nm.
3.5.2 Pengamatan makropatologi organ
Mencit yang telah dikorbankan harus segera diotopsi dan dilakukan pengamatan secara makropatologi berupa perubahan warna, permukaan dan
konsistensi dari organ.
3.5.3 Penimbangan organ
Organ yang akan ditimbang absolut harus dikeringkan terlebih dahulu dengan kertas penyerap, kemudian segera ditimbang, sedangkan yang dianalisis
adalah bobot relatif indeks organ, yaitu bobot organ absolut dibagi bobot badan.
3.5.4 Pemeriksaan histopatologi
Pemeriksaan histopatologi dilakukan di laboratorium anatomi kedokteran Sumatera Utara.Organ yang diperiksa adalah hati. Organ yang sudah dipisahkan
dicuci dengan menggunakan larutan fisiologis 0,9, kemudian dimasukkan dalam
25 larutan dapar formalin 10 dan dibuat preparat histopatologi dengan pewarnaan
hematoxylin eosin kemudian diperiksa di bawah mikroskop. Prosedur pembuatan preparat histopatologi:
a. Organ yang akan dihistologi direndam didalam larutan dapar formalin 10 pada suhu kamar.
b. Organ yang akan dihistologi dipotong, untuk hati dilakukan pemotongan pada lobus terbesar hati.
c. Untuk menghilangkan sisa formalin dilakukan pencucian dengan air mengalir.
d. Dilakukan proses dehidrasi dengan etanol 70, 80, 90, etanol absolut. Kemudian dilanjutkan dengan penjernihan menggunakan xylol sebanyak tiga
kali selama 1 jam. e. Proses penanaman dilakukan dengan cara: sampel direndam dalam campuran
xyloldan parafin cair pada suhu 60–70
o
C, dengan perbandingan xylol:parafin berturut-turut 3:1, 1:1, dan 1:3 masing-masing selama 2 jam.
f. Dilakukan pencetakan dan dibiarkan membeku, kemudian blok parafin
dipotong dengan menggunakan alat mikrotom dengan ketebalan irisan 5-7 µm. Setelah memperoleh potongan yang bagus, potongan tersebut
ditempelkan pada kaca obyek. Sayatan organ yang telah menempel pada kaca obyek segera diletakkan pada permukaan pemanas dengan suhu 56 - 58°C
selama kurang lebih 10 detik, sehingga organ meregang dan menempel pada kaca obyek sambil diatur jangan sampai organ berkerut atau melipat.
Selanjutnya preparat disimpan dalam suhu kamar untuk dilakukan pewarnaan.
26 g. Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan hematoxylin-eosin. Pertama
sediaan direndam dengan larutan xylol untuk proses deparafinasi masing- masing selama 12 menit. Dilakukan proses dehidrasi dengan merendam
preparat dalam etanol 70, 80, 90, etanol absolut selama 5 menit, dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya direndam dengan larutan hematoxylin
selama 5 menit, dicuci dengan air mengalir, dilakukan pewarnaan dengan eosin. Kemudian, dicelupkan ke dalam etanol 70, 80, 90, dan etanol
absolut masing-masing selama 10 menit. Terakhir dimasukkan kedalam xylol selama 12 menit. Preparat diamati dibawah mikroskop.
3.6 Analisis Data
Data jumlah hewan uji yang mati dianalisa secara statistik menggunakan SPSS dengan metode One Way Analysis of Variance ANOVA dilanjutkan
dengan uji post hoc Tukey untuk mengetahui perbedaan signifikan berat badan, berat organ relatif, konsumsi makan dan minum, serta kadar ALT
Alanin Aminotransferase .
27
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil IdentifikasiSampel
Hasil identifikasi yang dilakukan oleh Herbanium Medanense Universitas Sumatera Utara terhadap bahan yang diteliti adalahtumbuhan kelapa sawit Elaeis
guinensisJacq. suku Arecaceae.Hasilnya dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 45 dan Gambar tumbuhan pada Lampiran 2, halaman 46.
4.2 Hasil Ekstraksi Serbuk Daun Kelapa Sawit
Pembuatan ekstrak daun kelapa sawit dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 80. Hasil maserasi dari 1200 g serbuk simplisia
diperoleh ekstrak kental 108,0 g dan defreeze dryer suhu -40
o
C diperoleh ekstrak kering 98,0 g.
4.3 Hasil Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak Etanol Daun Kelapa Sawit
Hasil karakterisasi simplisia dan ekstrak dapat dilihat pada Tabel 4.1 dan perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 9 halaman 52 – 56.Monografi dari
simplisia daun kelapa sawit tidak ditemukan di buku Materia Medika Indonesia MMI, sehingga tidak ada acuan untuk menentukan parameter simplisia tersebut.
Tabel 4.1
Hasil karakterisasi simplisia dan ekstrak No
Parameter Hasil
Simplisia Ekstrak
1 Kadar air
6,64 2,65
2 Kadar sari larut air
13,49 19,57
3 Kadar sari larut etanol
16,98 43,88
4 Kadar abu total
3,75 2,43
5 Kadar abu tidak larut asam
0,78 0,24