E. Alat
Spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lamda 20; pH meter Metrohm 632; timbangan BP 160 P, scaltec SBC 22, dan precision balance model GB-3002
Mettler Toledo; mikropipet 10-100 l, 100-1000 l Acura 825, Socorex;
mikropipet 0,5-5,0 ml Socorex; tabung reaksi bertutup Pyrex-Germany; vaccum rotaevaporator
Buchi rotaevaporator; waterbath Abo-Tech; blender, dan alat-alat gelas yang lazim.
F. Tata Cara Penelitian 1. Pengambilan sampel
Diambil 100 bungkus sampel teh hijau merk X dari satu perusahaan teh di Yogyakarta dengan nomor batch yang sama. Seluruh sampel kemudian diambil
80 80 bungkus berdasarkan tabel Krecjie Sugiyono, 2005. Pengambilan sampel dilakukan secara acak menggunakan random numbers table lampiran 8.
2. Pembuatan serbuk teh hijau
Diambil 20 bungkus 1800 g teh hijau, dihomogenkan, digiling dan dihaluskan menggunakan blender. Serbuk yang didapat kemudian diayak dengan
ayakan nomor mesh 12 sampai 50 derajat halus serbuk 418. Serbuk yang digunakan adalah serbuk yang berada di atas ayakan nomor mesh 50 dan di bawah
ayakan nomor mesh 12. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3. Preparasi sampel a. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau
Pembuatan fraksi etil asetat dan fraksi air diawali dengan pembuatan ekstrak etanol teh hijau menggunakan metode penyarian remaserasi Anonim,
1986. Serbuk teh hijau sebanyak 300 g dimaserasi dengan cara direndam dalam 1 liter etanol 70 selama 24 jam di dalam bejana bertutup. Maserat yang didapat
disaring, filtrat dikumpulkan. Ampas dimaserasi lagi dengan 500 ml etanol 70 selama 24 jam, kemudian disaring, filtrat dikumpulkan, ampas dimaserasi lagi,
demikian seterusnya sampai filtrat hasil penyaringan jernih. Seluruh filtrat hasil remaserasi dicampur dan diuapkan pelarutnya dengan rotaevaporator sampai
kental. Ekstrak kental yang didapat diuapkan di atas penangas air hingga diperoleh ekstrak kering.
b. Pembuatan fraksi etil asetat dan fraksi air
Ekstrak etanol kering hasil remaserasi ditimbang sebanyak 75 g dan dilarutkan dalam 150 ml air, kemudian difraksinasi dengan 100 ml kloroform
menggunakan corong pisah, dengan pengulangan 6 kali. Fraksi air A
1
yang didapat kemudian dikumpulkan dan difraksinasi dengan 50 ml etil asetat
menggunakan corong pisah dengan pengulangan 12 kali sampai fraksi etil asetat jernih untuk mendapatkan jumlah senyawa terlarut dalam fraksi etil asetat yang
optimum. Fraksi etil asetat dan fraksi air A
2
yang diperoleh kemudian dikumpulkan, lalu diuapkan menggunakan rotaevaporator hingga kental. Sisa
penguapan diuapkan lagi di atas waterbath hingga kering, lalu disimpan dalam PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
desikator. Serbuk yang diperoleh kemudian ditimbang, dihitung rendemennya, dan digunakan sebagai sampel untuk uji penangkapan radikal hidroksil
menggunakan metode deoksiribosa. Proses preparasi sampel dapat dilihat pada gambar 9.
Filtrat dikumpulkan Filtrat dikumpulkan
300 g serbuk teh hijau
Ekstrak kering
Fraksi air A
2
Dimaserasi dengan 1000 ml etanol 70 , disaring
Residu dimaserasi dengan 500 ml etanol 70 , disaring diulangi sampai filtrat jernih
Residu dibuang Dievaporasi
Dilarutkan dalam 150 ml air Difraksinasi dengan 100 ml kloroform 6 kali
Fraksi kloroform Fraksi air A
1
Ditimbang 75 g ekstrak kering
Difraksinasi dengan etil asetat 50 ml 12 kali Fraksi etil asetat
Diuji aktivitas penangkapan radikal hidroksilnya dengan metode deoksiribosa
Dibuang
Gambar 9. Skema tata cara preparasi sampel ekstraksi dan fraksinasi
4. Persiapan uji penangkapan radikal hidroksil a. Pembuatan larutan bufer fosfat pH 7,4
Ditimbang seksama sebanyak 1,4196 g Na
2
HPO
4
kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 500,0 ml sehingga dicapai kadar 20 mM. Ditimbang
seksama lebih kurang sebanyak 0,6805 g KH
2
PO
4
kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 250,0 ml sehingga dicapai kadar 20 mM. Kedua larutan tersebut
dicampur sampai didapat larutan bufer fosfat dengan pH 7,4.
b. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM
Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,02012 g 2-deoksi-D-ribosa, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 15
mM. Dari larutan tersebut diambil 4,2 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 25,0 ml, sehingga didapat kadar 2,5 mM.
c. Pembuatan reagen Fenton
Reagen Fenton yang digunakan terdiri dari FeCl
3
1 mM, EDTA 1 mM, H
2
O
2
20 mM, dan Vitamin C 1 mM. 1. Larutan FeCl
3
1 mM Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,01352 g FeCl
3
. 6 H
2
O, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 5
mM. Dari larutan tersebut diambil 2,0 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 1 mM.
2. Larutan EDTA 1 mM Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,01861 g Na
2
EDTA. 2 H
2
O, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 5
mM. Dari larutan tersebut diambil 2,0 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 1 mM.
3. Larutan H
2
O
2
20 mM Diambil 0,091 ml H
2
O
2
30 , kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 80 mM. Dari larutan tersebut diambil 2,5
ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 20 mM.
4. Larutan Vitamin C 1 mM Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,01761 g vitamin C,
kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 10 mM. Dari larutan tersebut diambil 1,0 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai
10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 1 mM.
d. Pembuatan larutan TCA 5
Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 1,25 g TCA, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 25,0 ml sehingga dicapai kadar 5 bv.
e. Pembuatan larutan TBA 1
Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,25 g TBA, dimasukkan ke dalam beakerglass 100 ml dan ditambah akuades secukupnya, kemudian
dipanaskan di atas hot plate hingga seluruh TBA larut. Setelah itu, dilarutkan dalam akuades sampai 25,0 ml sehingga dicapai kadar 1 bv.
f. Pembuatan larutan uji fraksi etil asetat 1 mgml
Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 10 mg serbuk fraksi etil asetat, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai
konsentrasi 1 mgml.
g. Pembuatan larutan uji fraksi air 1 mgml
Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 10 mg serbuk fraksi air, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai konsentrasi
1 mgml.
5. Penentuan operating time OT
Diambil 600 l larutan deoksiribosa 2,5 mM, dimasukkan dalam tabung
reaksi bertutup, kemudian ditambah dengan 300 l FeCl
3
1 mM, 300 l EDTA 1
mM, 300 l H
2
O
2
20 mM, 4,2 ml bufer fosfat pH 7,4, dan 300 l vitamin C 1 mM.
Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit.
Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 dan 1,0 ml TBA 1 , dipanaskan dalam waterbath
pada suhu 80 C selama 30 menit sampai terbentuk kromogen MDA-
TBA yang
berwarna merah
muda, kemudian
didinginkan, dan
dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum teoritis
maks
teoritis 532 nm selama 60 menit.
6. Penentuan panjang gelombang maksimum
maks
Diambil 100, 300, dan 600 l larutan deoksiribosa 2,5 mM, dimasukkan
dalam tabung reaksi bertutup, kemudian masing-masing ditambah dengan 300 l
FeCl
3
1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H
2
O
2
20 mM, bufer fosfat pH 7,4 penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume larutan deoksiribosa yang
ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml, dan 300 l vitamin C
1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit.
Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 dan 1,0 ml TBA 1 , dipanaskan dalam waterbath
pada suhu 80 C selama 30 menit, sampai terbentuk kromogen MDA-
TBA yang
berwarna merah
muda, kemudian
didinginkan, dan
dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 400-600 nm selama operating time.
7. Pembuatan larutan kontrol
Diambil 600 l deoksiribosa 2,5 mM, dimasukkan dalam tabung reaksi
bertutup, kemudian ditambah dengan 300 l FeCl
3
1 mM, 300 l EDTA 1 mM,
300 l H
2
O
2
20 mM, 4,2 ml bufer fosfat pH 7,4, dan 300 l vitamin C 1 mM.
Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit.
Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 dan 1,0 ml TBA 1 , dipanaskan dalam waterbath
pada suhu 80 C selama 30 menit sampai terbentuk kromogen MDA-
TBA yang
berwarna merah
muda, kemudian
didinginkan, dan
dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi selama
operating time .
8. Uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat
Diambil fraksi etil asetat 1 mgml dengan volume 200, 400, 600, 800, dan 1000
l, masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup. Ke dalam tiap-tiap tabung tersebut kemudian ditambah dengan 600
l deoksiribosa 2,5 mM, 300
l FeCl
3
1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H
2
O
2
20 mM, bufer fosfat pH 7,4 penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume larutan fraksi
etil asetat yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml, dan 300
l vitamin C 1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 dan 1,0 ml TBA 1 ,
dipanaskan dalam waterbath pada suhu 80 C selama 30 menit, sampai terbentuk
kromogen MDA-TBA yang berwarna merah muda, kemudian didinginkan, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi selama
operating time .
9. Uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi air
Diambil fraksi air 1 mgml dengan volume 200, 400, 600, 800, dan 1000 l, masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup. Kemudian ke
dalam tiap-tiap tabung tersebut ditambah dengan 600 l deoksiribosa 2,5 mM,
300 l FeCl
3
1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H
2
O
2
20 mM, bufer fosfat pH 7,4 penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume larutan fraksi air yang
ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml, dan 300 l vitamin C
1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit.
Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 dan 1,0 ml TBA 1 , dipanaskan dalam PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
waterbath pada suhu 80
C selama 30 menit, sampai terbentuk kromogen MDA- TBA
yang berwarna
merah muda,
kemudian didinginkan,
dan dibaca
absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi selama operating time
.
G. Analisis Data
Kategori