perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
34
6. Uji Aktivitas Antibakteri
Langkah-langkah pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun jeruk bali Citrus maxima Merr. adalah sebagai berikut :
a. Penyiapan Alat Alat uji yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilisasi
dengan autoklaf pada suhu 121ºC, tekanan 1 atm selama 15 menit. b. Pembuatan Media
1 Media NA Nutrient Agar Media NA dibuat dengan cara mensuspensikan 20 gram NA dalam
aquadest sampai volume 1 liter. Larutan media dipanaskan hingga larut, dan dimasukkan dalam erlenmeyer, kemudian dilakukan sterilisasi
menggunakan autoklaf dengan suhu 121
o
C selama 15 menit. 2 Media NA Nutrient Agar dalam bentuk agar miring
Media NA dibuat dengan cara mensuspensikan 20 gram NA dalam aquadest sampai volume 1 liter, kemudian dipanaskan hingga larut dan
dimasukkan dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Selanjutnya media tersebut disterilkan terlebih dahulu sebelum
digunakan. Media disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C. Tabung reaksi selanjutnya dimiringkan agar media
NA didalamnya membeku berbentuk miring. 3 Media TSA Tryptone Soya Agar
Tryptone Soya Broth sebanyak 3 gram dilarutkan dalam 100 ml akuades dan ditambahkan 1 gram agar, kemudian dipanaskan hingga
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
35
larut. Untuk membuat media agar miring yang akan digunakan untuk stok bakteri, media TSA yang telah larut dimasukan kedalam tabung
reaksi steril sebanyak 5 ml kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
o
C. Tabung reaksi selanjutnya dimiringkan agar media TSA didalamnya membeku berbentuk miring.
4 Media NB Nutrient Broth Media NB dibuat dengan cara mensuspensikan 8 gram bubuk
media NB dalam aquadest, sampai volume 1 liter. Larutan media dipanaskan hingga larut, dan dimasukkan dalam erlenmeyer, kemudian
dilakukan sterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121
o
C selama 15 menit, jika diperlukan dapat dibagi terlebih dahulu kedalam wadah
yang lebih kecil sebelum disterilkan kemudian disimpan pada suhu 25
o
C dengan pH penyimpanan 7±0,2. 5 Media MHA Muller Hinton Agar
Media MHA dibuat dengan cara sebanyak 38 gram bubuk media MHA dilarutkan dalam aquadest, sampai volume 1 liter. Larutan
dipanaskan hingga larut, selanjutnya dimasukkan kedalam erlenmeyer dan dilakukan sterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121
o
C selama 15 menit. Media MHA yang sudah steril, didiamkan sampai
kisaran suhu 40-50ºC, kemudian secara aseptis dicampurkan kultur bakteri uji dengan perbandingan 1:100 bakteri : media.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
36
c. Pembuatan Stok Bakteri Uji Memindahkan dan membiakan koloni bakteri yang berasal dari
hasil pemisahan bakteri apusan darah jerawat dengan cara digoreskan 1-2 mata ose pada media agar miring yaitu media agar miring NA dan TSA
dalam tabung reaksi yang kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Diagram alir pembuatan stok bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9. Pembuatan Stok Bakteri Uji
d. Pembuatan Suspensi Bakteri Bakteri uji diambil 1-2 mata ose dari stok bakteri, dicampurkan
dalam 25 ml media NB Nutrient Broth steril. Dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu kamar dengan cara digoyang-goyang menggunakan
shaker dengan kecepatan 200 rpm selama 18-24 jam. e. Pembuatan Suspensi CMC-Na 0,1 bv
Suspensi CMC-Na 0,1 bv dibuat dengan cara melarutkan 0,05 gram serbuk CMC-Na dilarutkan dalam 50 ml aquadest.
Kultur bakteri bentuk
kokus Gram positif
Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam Digunakan sebagai stok
Kultur bakteri bentuk
basil Gram positif
Kultur bakteri bentuk
basil Gram negatif
distreak pada Media
Agar miring TSA
Masing-masing kultur distreak
pada Media Agar miring NA
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
37
f. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali Citrus
maxima Merr. Ekstrak etanol daun jeruk bali Citrus maxima Merr. dibuat 11 seri
konsentarsi 0-100 dengan menggunakan suspensi CMC-Na 0,1 bv. Setiap seri konsentrasi dibuat dengan menambahkan suspensi CMC-
Na 0,1 bv kedalam beberapa gram ekstrak etanol daun jeruk bali Citrus maxima Merr., sampai volumenya 5 ml. Komposisi bahan yang
digunakan dalam pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol daun jeruk bali Citrus maxima Merr. dapat dilihat dalam Tabel II.
Tabel II. Komposisi Bahan dalam Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali
Citrus maxima Merr.
Konsentrasi akhir ekstrak
Berat ekstrak etanol daun jeruk
bali gram Suspensi CMC-Na
0,1 bv ml 0,0
ad 5 10
0,5 ad 5
20 1,0
ad 5 30
1,5 ad 5
40 2,0
ad 5 50
2,5 ad 5
60 3,0
ad 5 70
3,5 ad 5
80 4,0
ad 5 90
4,5 ad 5
100 5,0
ad 5 Diagram alir pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol daun jeruk
bali Citrus maxima Merr. dapat dilihat pada Gambar 10.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
38
A
B
Diambil Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali
2,5 gram Ditambah
Suspensi CMC- Na sampai 5 ml
Didapat Konsentrasi
Ekstrak 50 bv Konsentrasi
Ekstrak 70 bv 3,5 gram
gram Ditambah
Suspensi CMC- Na sampai 5 ml
Didapat Konsentrasi
Ekstrak 40 bv 2 gram
gram Ditambah
Suspensi CMC- Na sampai 5 ml
Didapat Konsentrasi
Ekstrak 60 bv 3 gram
gram Ditambah
Suspensi CMC- Na sampai 5 ml
Didapat Diambil
Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali
0,5 gram Ditambah
Suspensi CMC- Na sampai 5 ml
Didapat Konsentrasi
Ekstrak10 bv Konsentrasi
Ekstrak 20 bv 1 gram
gram Ditambah
Suspensi CMC- Na sampai 5 ml
Didapat Konsentrasi
Ekstrak 0 bv 0 gram
gram Ditambah
Suspensi CMC- Na sampai 5 ml
Didapat Konsentrasi
Ekstrak 30 bv 1,5 gram
gram Ditambah
Suspensi CMC- Na sampai 5 ml
Didapat
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
39
C Gambar 10. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali. A
Pembuatan Konsentrasi Ekstrak 0-30 bv. B Pembuatan Konsentrasi Ekstrak 40-70 bv. C Pembuatan Konsentrasi Ekstrak 80-100 bv
g. Larutan Kontrol Kontrol yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri ini terdiri
dari : 1 Kontrol suspensi CMC-Na 0,1 bv
2 Kontrol etanol 75 3 Kontrol antibiotik Klindamisin 0,025
h. Pengujian Aktivitas Antibakteri Metode Difusi Padat Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan menggunakan metode difusi
padat dengan langkah kerja sebagai berikut : 1 Menyiapkan media uji MHA disterilisasi pada suhu 121°C selama 15
menit kemudian didinginkan hingga 40-50°C
Diambil
4,5 gram Ditambah
Suspensi CMC- Na sampai 5 ml
Didapat Konsentrasi
Ekstrak 90 bv Konsentrasi
Ekstrak 80 bv 4 gram
gram Ditambah
Suspensi CMC- Na sampai 5 ml
Didapat Konsentrasi
Ekstrak 100 bv 5 gram
gram Ditambah
Suspensi CMC- Na sampai 5 ml
Didapat Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
40
2 Suspensi bakteri uji yang berusia 24 jam dipindahkan ke dalam MHA yang bersuhu 40-50°C sebanyak 1 dari volume total MHA,
kemudian dihomogenkan. 3 Menuang media MHA ke dalam cawan petri sebanyak 15 ml dan
dibiarkan memadat. 4 Membuat lubang sumuran dengan menggunakan pelubang gabus
dengan diameter lubang sebesar 6 mm pada media MHA padat. 5 Memasukkan 20µ L seri konsentrasi ekstrak etanol daun jeruk bali,
kontrol pelarut ekstrak CMC-Na 0,1 bv, etanol 75 dan antibiotik Klindamisin 0,025 ke dalam masing-masing lubang, kemudian diberi
label dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. 6 Mengukur diameter zona hambat pada masing-masing sumuran
menggunakan jangka sorong dengan pengukuran sebanyak 3 kali untuk tiap lubang.
7 Replikasi dilakukan sebanyak 2 kali pada tiap pengujian. Nilai diameter zona hambat dari kedua replikasi tersebut dirata-rata.
8 Membandingkan nilai diameter zona hambat antar bakteri uji. Diagram alir pengujian aktivitas antibakteri metode difusi padat dapat
dilihat pada Gambar 11.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
41
Gambar 11. Pengujian Aktivitas Antibakteri Metode Difusi Padat
Replikasi 2 kali Diukur diameter zona hambat
Diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam
Perhitungan 3 kali masing-masing lubang Dituang sebanyak 15 ml ke cawan petri
Dibiarkan hingga media memadat Dibuat lubang pada media
Dimasukkan 20µL larutan seri konsentrasi ekstrak dan larutan kontrol CMC-Na, kontrol etanol dan kontrol antibiotik ke dalam lubang
Bakteri dan media dihomogen Suspensi
bakteri uji Media uji MHA disterilisasi
Media MHA yang bersuhu 40-50ºC
Dibandingkan hasil pada sampel uji dengan kontrol suspensi CMC-Na 0,1 , kontrol etanol 75 dan kontrol antibiotik Klindamisin 0,025
Membandingkan nilai diameter zona hambat antar bakteri uji
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
42
E. Analisis Hasil
Kategori