16
BAB III METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan Mikrobiologi Fakultas Farmasi USU Medan. Penelitian dilakukan berdasarkan metode
eksperimental dengan meneliti pengaruh variabel bebas yaitu tingkat hidrolisis 25, 50, 75 dan 100 minyak kelapa murni terhadap variabel terikat yaitu
daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli di dalam whipped cream yang dilakukan dengan metode Angka
Lempeng Total.
3.1 Alat-alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca listrik maximum Sartorius, Jepang, Hotplate Heidolp, Jerman, Pendingin Tegak, Buret, Statif,
Penangas air, klem, bola karet, autoklaf Fisons, inkubator Fiber Scientific, jarum ose, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF 1200L, lemari pendingin
Toshiba, Hand Mixer Tiger, cawan petri, pipet tetes, mikroskop Olympus CX31, oven Memmert, kamera Sony, indikator universal Merck, dan alat-
alat gelas sesuai kebutuhan.
3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah natrium hidroksida, kalium hidroksida, metanol, asam klorida, n-heksan, natrium sulfat,
indikator fenolftalein, akuades. Bahan untuk pembuatan whipped cream yaitu mentega putih dan susu kental manis produksi PT. Frisian Flag Indonesia. Bahan
pembuatan media bakteri yaitu
media Plate Count Agar Oxoid, media Nutrient
Universitas Sumatera Utara
17
Agar Oxoid,
natrium klorida. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus ATCC 29737 dan Escherichia coli ATCC 87064, serta
minyak kelapa murni produksi Noery Vico Lhokseumawe – NAD. Gambar minyak kelapa murni yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 1.
3.3 Penyiapan Bahan 3.3.1 Pembuatan Larutan Pereaksi
3.3.1.1 Larutan HCl 0,5 N
Sebanyak 41,39 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 1000 ml. Kemudian dilakukan pembakuan HCl 0,5 N dengan cara ditimbang
sebanyak 0,25 gram natrium karbonat yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 270
O
C selama 1 jam, kemudian dilarutkan dalam 100 ml air. Dititrasi dengan larutan asam klorida menggunakan indikator merah metil sampai berwarna merah
muda. Larutan dipanaskan hingga mendidih, kemudian didinginkan dan dititrasi kembali. Dipanaskan lagi hingga mendidih, dan dititasi lagi hingga warna merah
muda tidak hilang dengan pendidihan lebih lanjut Ditjen POM, 1995.
3.3.1.2 Larutan NaOH metanol 0,5 N
Ditimbang sebanyak 20 gram pelet natrium hidroksida, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga 1000 ml. Kemudian dilakukan pembakuan
NaOH metanol 0,5 N dengan cara dipipet sebanyak 10 ml NaOH metanol 0,5 N kemudian dititrasi dengan HCl 0,5 N dengan menggunakan indikator fenolftalein
sampai warna merah muda.
3.3.1.3 Larutan Merah Metil
Dilarutkan 100 mg merah metil dalam 100 ml etanol.
Universitas Sumatera Utara
18
3.3.1.4 Larutan Fenolftalein
Dilarutkan 1 gram fenolftalein dalam 100 ml etanol.
3.3.1.5 Larutan KOH 0,1 N
Ditimbang sebanyak 5,61 gram pelet kalium hidroksida, kemudian dilarutkan dalam air hingga 1000 ml. Kemudian dilakukan pembakuan KOH 0,1
N dengan cara ditimbang sebanyak 0,3 gram kalium biftalat yang sebelumnya telah dihaluskan dan dikeringkan pada suhu 120
O
C selama 2 jam, dan dilarutkan dalam 75 ml air bebas karbon dioksida. Ditambahkan 2 tetes fenolftalein dan
dititrasi dengan larutan kalium hidroksida hingga terjadi warna merah muda mantap.
3.3.1.6 Larutan Alkohol 95 Netral
Sebanyak 480 ml alkohol 99 dilarutkan dalam air suling sampai 500 ml. Kemudian larutan dipindahkan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan beberapa tetes
indikator fenolftalein dan dititrasi dengan larutan KOH 0,1 N sampai terbentuk warna merah muda.
3.3.2 Penyiapan Alat dan Bahan untuk Pengujian Sifat Antibakteri 3.3.2.1 Sterilisasi Alat
Alat-alat dan bahan untuk pemeriksaan mikrobiologi harus disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterikan di oven pada suhu
170
O
C selama 2 jam dan media yang digunakan disterilkan di autoklaf pada suhu 121
O
C selama 15 menit ,
jarum ose dibakar dengan lampu bunsen. 3.3.2.2 Pembuatan Media Nutrient Agar
Komposisi: Beef Extract
3 gram Peptone
5 gram
Universitas Sumatera Utara
19 Agar
15 gram Air suling sampai
1 liter Sebanyak 28 gram serbuk Nutrient Agar NA dilarutkan dalam air suling
hingga 1 liter dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
O
C selama 15 menit Oxoid, 2006.
3.3.2.3 Pembuatan Media Plate Count Agar
Komposisi: Trypton
5,0 gram Ekstrak yeast
2,5 gram Glukosa
1,0 gram Agar
9,0 gram Air suling sampai
1 liter Sebanyak 17,5 gram serbuk Plate Count Agar PCA dilarutkan dalam air
suling sebanyak 1 liter, dipanaskan sampai mendidih sampai semua serbuk PCA larut, disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
O
C selama 15 menit Oxoid, 2006.
3.3.2.4 Pembuatan Larutan NaCl 0,9
Natrium klorida ditimbang sebanyak 9 gram lalu dilarutkan dalam air suling sedikit demi sedikit dalam labu ukur 1000 ml sampai larut sempurna. Lalu
ditambahkan air suling sampai garis tanda. Larutan kemudian dipindahkan ke dalam wadah kaca dan disterilkan di autoklaf pada suhu 121
O
C selama 15 menit. 3.3.2.5 Pembuatan Agar Miring
Kedalam tabung reaksi dimasukkan 3 ml media nutrien agar, didiamkan pada suhu kamar sampai sediaan membeku pada posisi miring 45
O
kemudian disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5
O
C.
Universitas Sumatera Utara
20
3.4 Hidrolisis Minyak Kelapa Murni
Untuk penentuan bilangan penyabunan dilakukan prosedur sebagai berikut yaitu sejumlah 10 gram minyak ditimbang dalam labu alas 250 ml. Ditambahkan
100 ml NaOH metanol 0,5 N. Labu alas dihubungkan dengan pendingin tegak dan dipanaskan sampai tersabunkan sempurna 3 jam. Selanjutnya larutan
didinginkan dan ditambahkan 1 ml larutan indikator fenolftalein, kemudian dititrasi dengan HCl 0,5 N sampai warna merah jambu menghilang. Bilangan
Penyabunan dihitung dengan rumus: ml NaOH x N NaOH – ml HCl x N HCl
Bilangan Penyabunan = x BM NaOH
gram minyak Untuk hidrolisis parsial dari minyak dilakukan dengan memodifikasi
prosedur bilangan penyabunan diatas, yaitu dengan mengurangi volume NaOH yang digunakan sesuai dengan tingkat hidrolisis. Volume NaOH yang digunakan
dapat dilihat pada Lampiran 3. Sejumlah 50 gram minyak ditimbang kemudian ditambahkan NaOH
metanol 0,5 N sesuai tingkat hidrolisis 25, 50, 75 dan 100 kemudian labu alas dihubungkan dengan pendingin tegak dan dipanaskan selama 3 jam. Setelah
penyabunan selesai maka campuran ditambahkan HCl 0,5 N untuk membebaskan asam lemak yang tersabunkan, selanjutnya diekstraksi 2 kali masing-masing
dengan 50 ml n-heksan sehingga terbentuk dua lapisan. Lapisan atas fraksi n- heksan dikumpulkan kemudian ditambahkan 50 mg Na
2
SO
4
anhidrat dan didiamkan selama 15 menit. Selanjutnya diuapkan di atas penangas air dalam
cawan penguap untuk menghilangkan n-heksan. Minyak yang diperoleh
Universitas Sumatera Utara
21 ditambahkan dalam pembuatan whipped cream dan diuji sifat antibakterinya
Permata, 2012.
3.5 Penentuan Bilangan Asam Minyak Kelapa Murni dan Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Murni
Kategori