Saran Uji potensi isolat lokal Aspergillus flavus sebagai penghasil aflatoksin

43

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Hasil seleksi menggunakan metode ELISA menunjukkan bahwa dari sepuluh isolat yang terdiri atas 55 sampel yang diuji, terdapat 7 isolat yang terdiri atas 38 sampel yang mampu menghasilkan aflatoksin dengan isolat S.26 sebagai sampel yang paling banyak memproduksi AFB1 dengan jumlah terdeteksi sebesar 1212,3 ppb. Hasil analisis TLC menunjukkan bahwa isolat S.26 yang diperoleh dari media GAN termodifikasi n=5 tidak menghasilkan aflatoksin. Sementara itu hasil analisis TLC terhadap isolat S.26 dari media PDB secara konstan menunjukkan adanya produksi aflatoksin pada tiap ulangan n=5. Koloni pada media PDB memiliki ciri morfologis berwarna kuning kehijauan dan berubah menjadi hijau tua pada koloni yang sudah tua. Hal tersebut mengindikasikan bahwa koloni pada media PDB telah menghasilkan spora yang mengindikasikan adanya produksi aflatoksin. Hasil analisis TLC untuk sampel JCM dari media PDB menunjukkan bahwa semua ulangan menunjukkan produksi tertinggi pada hari ke-12 dengan rata-rata produksi aflatoksin sebesar 240 ppb dalam kisaran produksi 150-400 ppb. Sementara itu, sampel S.26 dari media PDB keempat ulangan menunjukkan produksi tertinggi pada hari 9-12 dengan kisaran produksi 200-500 ppb dan rataan konsentrasi aflatoksin sebesar 310 ppb. Hasil analisis HPLC berbeda dengan TLC. Hasil HPLC menunjukkan bahwa sampel isolat S.26 memiliki nilai produksi maksimum aflatoksin sebesar 935,8 ppb yang diperoleh pada hari ke-9, sedangkan sampel isolat JCM memiliki nilai produksi maksimum sebesar 847,69 ppb yang diperoleh pada hari ke-12. Kandungan aflatoksin sampel isolat lokal S.26 mengalami penurunan apabila dibandingkan dengan hasil seleksi yang diperoleh menggunakan teknik ELISA. Penurunan nilai produksi maksimum aflatoksin disebabkan oleh adanya pengaruh faktor kesalahan positif dalam analisis karena adanya reaksi silang pada uji ELISA. Aflatoksin yang terkandung dalam isolat lokal S.26 memiliki potensi untuk dijadikan kandidat standar dalam analisis aflatoksin namun masih harus melalui proses purifikasi lebih lanjut karena tingkat kemurnian yang diperoleh belum memenuhi persyaratan standar. Hal tersebut dapat dilihat dari masih banyaknya komponen non-aflatoksin B 1 pada kromatogram.

B. Saran

Optimasi hasil seleksi bisa dilakukan mnggunakan ELISA kit dengan konjugat yang telah diverifikasi terlebih dahulu dan hasil yang diperoleh langsung dikonfirmasi dengan metode HPLC. Media yang digunakan sebaiknya sudah menjalani uji potensi untuk memastikan bahwa media tersebut mendukung produksi aflatoksin optimum termasuk pengaruh pH awal dan nutrien yang diberikan. Penggunaan instrumen seperti HPLC maupun GC-MS bisa dijadikan alternatif metode TLC untuk menghindari adanya data yang membutuhkan pengukuran subjektif. Proses purifikasi lebih lanjut juga dapat dilakukan untuk mencapai kemurnian yang memenuhi persyaratan untuk dijadikan standar acuan dalam analisis aflatoksin. 44

VI. DAFTAR PUSTAKA

Abbas, H. K. 2005. Aflatoxin and Food Safety. London: CRC Press, Taylor Francis Group. Aryantha, I. N. P., Lunggani, A. T. 2007. Suppression on the aflatoxin-B production and the growth of Aspergillus flavus by lactic acid bacteria Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum. Biotechnology 62: 257-262. Azab, R. M., Tawakkol, W. M., Hamad, A. M., Abou-Elmagd, M. K., El-Agrab, H. M., Refai, M. K. 2005. Detection and estimation of aflatoxin B1 in feeds and its biodegradation by bacteria and fungi. Egyptian Journal of Natural Toxins 2:39-56 Bahri, S., Maryam, R. 2003. Mikotoksin berbahaya dan pengaruhnya terhadap kesehatan hewan dan manusia. Jurnal Mikologi Kedokteran Indonesia 4-51-2: 31-34. Bainton, S. J., Coker, R. D., Jones, B. D., Morlet, E. M., Nagreland, M. J., Turner, R. L. 1980. Mycotoxin Training Manual. London: Tropical Product Institute. Bhatnagar, D., Cleveland, T. E., Payne, G.A. 2000. Encyclopedia of Food Microbiology: 72–79. London: Academic Press. Bilgrami, K. S., Sinha, S. P., Jeswal, P. 1988. Loss of toxigenicity of Aspergillus flavus strain during subculturing: a genetic interpretation. Curr Sci 57: 551-552. Binder, H. M., Tan, L. M., Chin, L. J., Handl, J., Richard, J. 2007. Worldwide occurence of mycotoxins in commodities, feeds and feed ingredients. Animal Feed Science and Technology 137: 265-282. Brian, P. W., Dawking, A. W. 1961. Phytotoxic compounds produced by Fusarium sp. J. Espel. Botany 12:1-12. Buchanan, R. L., Ayres, J. C. 1975. Effect of initial pH on aflatoxin production. Applied Microbiology 306: 1050-1051. Burgess, G. W. 2005. Prinsip dasar ELISA dan variasi konfigurasinya, teknologi ELISA dalam diagnosis dan penelitian. Di dalam: Yusrini, H. Teknik analisis kandungan aflatoksin B1 secara ELISA pada pakan ternak dan bahan dasarnya. Buletin Teknik Pertanian Vol. 10. Cardwell, K. F., Henry, S. H. 2005. Risk of exposure to and mitigation of effects of aflatoxin on human health: A west African example. Di dalam: Abbas, H. K. ed. Aflatoxin and Food Safety . London: CRC Press, Taylor and Francis Group. 45 Carvalho, A. L. U., Oliveira, F. H. P. C., Mariano, R. L. R., Gouveia, E. R., Souto-Maior, A. M. 2010. Growth, sporulation, and production of bioactive compounds by Bacillus subtilis R14. Brazilian Archives of Biology and Technology 533: 643-652. Chiou, C. H., Miller, M., Wilson, D. L., Trail, F., Linz, J. E. 2002. Chromosomal location plays a role in regulation of aflatoxin gene expression in Aspergillus parasiticus. Applied environ. Microbiol. 68: 306-315. Ciegler, A., Peterson, R. E., Lagoda, A. A., Hall, H. H. 1966. Aflatoxin production and degradation by Aspergillus flavus in 20-litres fermentors. Applied Microbiology 145: 826-833. Davis, N. D., Diener, U. L., Eldridge, D. W. 1966. Production of aflatoxins B1 and G1 by Aspergillus flavus in semisynthetic medium. Applied Microbiology 143: 378-380. Devegowda G., Raju, M. V. L. N., Afzali, N., Swamy, H. V. L. N. 1998. Mycotoxin picture worldwide: Novel solutions for their counteraction. Passport to the year 2000: Biotechnology in feed industry. Proceedings of Alltech’s 14th Annual Symposium : 241- 255. Diaz G. J., Espitia, E. 2006. Occurence of aflatoxin M1 in retail milk samples from Bogota, Columbia. Food Additives and Contaminants 238: 811-815. Diener. U. L., Davis, N. D. 1969. Aflatoxin formation by Aspergillus flavus. Di dalam: L. A. Goldblatt ed.. Aflatoxin: Scientific Background, Control and Implication. New York: Academic Press. D’Mello, J. P. F. 2002. Mycotoxins in cereal grains, nuts, and other plan products. Di dalam: D’Mello, J. P. F ed. Food Safety Contaminants and Toxins. Trowbridge: Cromwell Press. Egmond, Hans. P., Jonker, Marco. A. 2005. Worldwide regulations on aflatoxins. Di dalam: Abbas, H. K ed. Aflatoxin and Food Safety. London: CRC Press- Taylor Francis Group. Fente, C. A.., Ordaz, J. Jaimez., Vazquez, B. I., Franco, C. M., Cepeda, A. 2001. New additive for culture media for rapid identification of aflatoxin-producing Aspergillus strain. Appl. Environ. Microbiol. 6710: 4858-4862. Frazier, W. C., D. C. Westhoff. 1978. Food Mycrobiology. New York : McGrow-Hill Book Co. Fried, B., Sherma, J. 1999. Thin Layer Chromatography 4th edition. New York : Marcel Dekker Inc. Gilbert, J., Vargas, E. A. 2005. Advances in sampling and analysis for aflatoxins in food and animal feed. Di dalam: Abbas, H. K ed. Aflatoxin and Food Safety. London: CRC Press-Taylor Francis Group. Goldblatt, L. A. 1969. Aflatoxin Scientific Background, Control and Implication. New York : Academic Press. 46 Hahn-Deinstrop, Elke. 2007. Applied Thin Layer Chromatography: Best Practice and Avoidance of Mistakes, 2nd edition . Weinhein: WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. KgaA. Hamid, A. B., Smith, J. E. 1987. Degradation of aflatoxin by Aspergillus flavus. Journal of General Microbiology 133: 2023-2029. Hedayati, M. T., Pasqualotto, A. C., Warn, P. A., Bowyer, P., Denning. D. W. 2007. Aspergillus flavus : human pathogen, allergen, and mycotoxin producer. Microbiology 153: 1677-1692. Hocking, A. D. 2006. Aspergillus and related teleomorphs. Di dalam: C. W. Blackburn Ed. Food Spoilage Microorganisms . Woodhead : CRC Press. Horn, B., Dorner, J. W. 2001. Effect of competition and adverse culture condition on aflatoxin production by Aspergillus flavus through successive generations. Mycologia 945: 741- 751. Jones, B. D. 1972. Methods of Aflatoxin Analysis. London: Tropical Products Institute. Kasno, A. 2004. Pencegahan infeksi Aspergillus flavus dan kontaminasi aflatoksin pada kacang tanah. Jurnal Litbang Pertanian 233: 75-81. Kusumaningtyas E. 2007. Potensi kapang Aspergillus sp. dalam memproduksi aflatoksin unpublished research. Lee, N. A., Wang, S., Allan, R. D., Kenndedy, I. R. 2004. A rapid aflatoxin B1 ELISA: development and validation with reduced matrix effects for peanuts, corn, pistachio, and soybeans. J. Agric. Food Chem. 52: 2746-2755. Lilieanny, D. O. S., Putri, A. S. R. 2005. Populasi kapang pascapanen dan kandungan aflatoksin pada produk olahan kacang tanah. Jurnal Mikologi Indonesia 101: 17-20. Makfoeld, D. Mikotoksin Pangan. 1993. Jakarta: Penerbit Kanisius. Maggon, K. K., Viswanathan, L., Venkitasubramanian, T. A. 1969. Aflatoxin production by some indian strains of Aspergillus flavus link ex fries. J. Gen. Microbiology 59: 119-124. Maryam, R. 1996. Residu aflatoksin dan metabolitnya dalam daging dan hati ayam. Prosiding pada Temu Ilmiah Nasional Bidang Veteriner, 12-13 Maret 1996, Bogor. pp: 336-338. Maryam, R. 2009. Uji Potensi Isolat Lokal Aspergillus flavus Koleksi Balitvet Culture Collection BCC Komunikasi pribadi. Maryam, R., Bahri, S., Zahari, P. 1995. Deteksi aflatoksin B1, M1 dan aflatoksikol dalam telur ayam ras dengan kromatografi cair kinerja tinggi. Prosiding pada Seminar Nasional Teknologi Veteriner untuk Meningkatkan Kesehatan Hewan dan Keamanan Bahan Pangan Asal Ternak, 22-24 Maret 1994, Cisarua, Bogor. pp: 412-416. 47 Maryam R., Sani, Y., Djuariah, S., Firmansyah, R., Miharja. 2003. Efektivitas ekstrak bawang putih Allium sativum linn. dalam penanggulangan aflatoksikosis pada ayam petelur. J. Ilmu Ternak dan Vet. 84: 239-246. Martins, H. M., Almedia, I., Marques, M., Bernardo, F. 2008. Interaction of wild strains of Aspergillus parasiticus ATCC15517 on aflatoxins production. Int. J. Mol. Sci. 9:334-400. Meilawati. 2007. Unjuk Kerja Metode Penetapan Kadar Residu Aflatoksin G1, B1, G2, dan B2 pada Jagung Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT [Laporan Magang]. Bogor: Balai Besar Penelitian Veteriner. Miller, J. D., H. L. Trenholm. 1994. Mycotoxin in Grain Compound Other than Aflatoxin. . St. Paul , Minnesota : Eagan Press. Nazari, S. H. 2010. Sonicated date syrup media preparation for microbial culture. African Journal of Biotechnology 103: 424-432. Omaye, S. T. 2004. Food and Nutritional Toxicology. New York: CRC Press. Onions, A. H. S. 1982. Mycotoxigenic Fungi. Di dalam: Roberts, J. B. L. D., Skinner, F. A. eds.. Isolation and Identification Methods for Food Poisoning Organism . New York: Academic Press. Oswald, I. P., Comera, C. 1998. Immunotoxicity of mycotoxins. Rev. Med. Vet. 149: 239-245. Patey, A. L., Sharman, M., Gilbert, J. 1992. Determination of total aflatoxin levels in peanut butter by enzyme linked imunnosornbent assay: Collaborative study. J.AOAC International 754: 693–697. Pitt, J. I. 2006. Penicillium and related genera. Di dalam: C. W. Blackburn ed. Food Spoilage Microorganisms . Woodhead: CRC Press. Pitt, J. I., Hocking, A. D. 1997. Fungi and Food Spoilage 2nd Edition. Blackie Academic Professional. An Imprint of Chapman Hall. pp. 593. Rachmawati, S. 2005. Kit ELISA AFLAVET untuk deteksi aflatoksin pada produk pertanian. Seminar Nasional Teknologi Pertanian dan Veteriner. pp: 1005-1010. Rachmawati, S., Lee, A., Murdiati, T. B., Kennedy, I. 2004. Pengembangan Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA untuk analisis aflatoksin B1 pada pakan ternak. Prosiding pada Seminar Parasitologi dan Toksikologi Veteriner. Kerjasama Balai Penelitian Veteriner, Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan dengan Department for Internatinal Development DfID-UK, 20–21 April 2004, Bogor. Reddy, K. R. N., Raghavender, C. R., Reddy, B. N., Salleh, B. 2010. Biological control of Aspergillus flavus growth and subsequent aflatoxin B1 production in sorghum grains. African Journal of Biotechnology 927: 4257-4250. 48 Reddy, K. R. N., Saritha, P., Reddy, C. S., Muralidharan, K. 2009. Aflatoxin B1 producing potential of Aspergillus flavus strains isolated from stored rice grains. African Journal of Biotechnology 814: 3303-3308. Reddy, S. V., Waliyar, F. 2010. Properties of aflatoxin and it producing fungi. http:www.icrisat.orgaflatoxinaflatoxin.asp. [13 Feb 2011] Reddy, T. V., Viswanathan, L., Venkitasubramanian. 1971. High aflatoxin production on a chemically defined medium. Applied microbiology 223: 393-396. Richard-Mollard, D., H. Bizot. J. L. Multon. 1982. Activita de I’eau. Facteur essentiel of de I’evolution microbioloque de aliments. Volume 2: 3-17. Ruiqian, L., Qian, Y., Thanaboripat, D., Thansukon, P. 2004. Biocontrol of Aspergillus flavus and aflatoxin production. Di dalam: Abbas, H. K ed. Aflatoxin and Food Safety. London: CRC Press, Taylor Francis Group Sardjono., Rahayu, K., Sudarmadhi, S. 1992. Growth and aflatoxin production by Aspergillus flavus in mixed culture with Aspergillus oryzae. ASEAN Food Journal 71: 30-33. Sauer, D. B. 1986. Condition that affect growth of Aspergilllus flavus and production of aflatoxin in stored maize. Page 41-50. In proceedings of the Workshop. El Batan, Mexico. Saxena, M., Mukerji, K. G., Raj, H. G. 1988. Positive correlation exists between glutathione S- transferase activity and aflatoxin formation in Aspergillus flavus. Biochem. J. 254: 567-570. Scheidegger ,K. A., Payne, G. A. 2003. Unlocking the secrets behind secondary metabolism: a review of Aspergillus flavus from pathogenicity to functional genomics. Journal Toxicol. 22: 423– 459. Sekhon, C. P. S., Kapur, J., Sodhi, S. S., Jand, S. K. 1996. Qualitative and quantitative detection of aflatoxin B1 in poultry sera by enzyme-linked immunosorbent assay. J. Biosci 214: 471- 476. Shier, W. T., Abbas, H. K. Weaver, M. A., Horn, B. W. 2005. The case for monitoring Aspergillus flavus aflatoxigenity for food safety assessment in developing countries. Di dalam: Abbas, H. K ed. Aflatoxin and Food Safety. London: CRC Press, Taylor and Francis Group. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J. 2007. Fundamentals of Analytical Chemistry. Drenthe: Saunders College Publishing. Smith, J. E. and J. A. Pateman. 1977. Genetics and Physiology of Aspergillus. New York : Academic Press. Stanker, L. H., Beier, R. C. 1995. Introduction to immunoassay for residue analysis: Concept, formats and applications iniImmunoassays for residue analysis. Di dalam: ELISA Workshop: 49 Simple Test for Monitoring Mycotoxins and Pestisides in Produce. Post Harvest Technology Insitute, November 15–17th 1999, Ho Chi Minh City, Vietnam. pp. 12–22. Steyn, P. S. 1991. The Biosynthesis of Mycotoxins. A study Secondary Metabolism. New York: Academic Press. Syarief, R., Ega, L., Nurwitri, C. C. 2003. Mikotoksin Bahan Pangan. Bogor: IPB Press. Van Eijkeren, J. C. H., Bakker, M. I., Zeilmaker, M. J. 2006. A simple steady-state model for carry- over of aflatoxins from feed to cow’s Milk. Food Additives and Contaminants 238: 833- 838. Verma, R. J. 2004. Aflatoxin cause DNA damage. International Journal of Human Genetics 44: 231- 236. Vujanovic, V., Smoragiewicz, W., Krzysztyniak, K. 2001. Airborne fungal ecological niche determination as one of the possibilities for indirect mycotoxin risk assessment in indoor air. EnvironToxicol 16: 1–8 Yu, J., Bhatnagar, D., Ehrlich, K. C. 2002. Review: Aflatoxin biosynthesis. Rev Iberoam Micol 19: 191-200. Yusrini, H. 2005. Teknik analisis kandungan aflatoksin B1 secara ELISA pada pakan ternak dan bahan dasarnya. Buletin Teknik Pertanian Vol. 10. Wang, J. S., Tang, L. 2005. Epidemiology of aflatoxin exposure and human liver cancer. Di dalam: Abbas, H. K ed. Aflatoxin and Food Safety. London: CRC Press, Taylor Francis Group. Weck, R., Van Putte, R. 2006. A simple and rapid ELISA for detecting aflatoxin contamination in corn. The American Biology Teacher 68 8: 492-495. Wilson, R. I., Mathers, D. T., Mabury, S. A. 2000. ELISA dan GC-MS as teaching tools in the undergraduate environmental analytical chemistry laboratory. Journal of Chemical Education 7712: 1619-1620. Winn, R. T., Lane, G. T. 1978. Aflatoxin production on high moisture corn and sorghum with a limited incubation. J. Dairy Sci 61: 762-764. Zahn, M., Lee-Joung, M., Wang, D., Trinh, T., Fay, Brooke., Ma, W. 2009. Product-specific sample clean-up and HPLC analysis of aflatoxins for a dietary Product. Phytochem. Anal. 20:335- 337. 50 LAMPIRAN 51 Lampiran 1. Tabel Hasil Seleksi dengan ELISA Sampel Kadar aflatoksin terukur ppb Faktor Pengenceran FP Kadar aflatoksin ppb S3 A d 6809 0,5 65,61 31,4 B 3809 - n.d C 31709 12,3 40 491,4 D 29709 6,7 40 267 E 27709 13,4 40 534 S5 A 6809 10,8 40 433,7 B 3809 2,5 40 101,2 C 31709 5,5 40 219,9 D d 29709 3,6 65,61 234,2 E 27709 5,5 40 219,9 S9 A 6809 4,5 40 178,6 B 3809 7,6 40 302,5 C 31709 5,6 40 223 D 29709 4,5 40 178,6 E 27709 6,7 40 267 S11 A 6809 6,2 40 249 B 3809 2,7 40 108,4 C 31709 0,5 40 18,1 D 29709 3,4 40 135, 4 E 27709 1,0 40 38,3 52 Sampel Kadar aflatoksin terukur ppb Faktor Pengenceran FP Kadar aflatoksin ppb S14 A 27709 2,8 10 27,7 B 29709 2,9 10 29,4 C 31709 87,9 10 878,6 D 3809 14,6 10 145,7 E 6809 8,0 10 79,9 S17 A 27709 n.d - n.d B 29709 n.d - n.d C 31709 n.d - n.d D 3809 n.d - n.d E 6809 n.d - n.d S19 A 6809 n.d - n.d B 3809 n.d - n.d C 31709 n.d - n.d D 29709 n.d - n.d E 27709 n.d - n.d S23 A 6809 n.d - n.d B 3809 n.d - n.d C 31709 n.d - n.d D 29709 n.d - n.d E 27709 n.d - n.d S26 A 6809 3,6 40 143,1 B 3809 3,6 40 145,1 C d,e 31709 18,5 65,61 1212,3 D 29709 2,7 40 108,41 E 27709 8,0 40 319,7 F-0213 A 6809 1,6 40 64,9 B f 3809 3,9 65,61 252,8 C 31709 0,6 40 25,6 D 29709 2,1 40 84,5 E 27709 0,4 40 14,7 53 Contoh perhitungan: Sampel JCM D 3809 Kadar aflatoksin ppb = Kadar aflatoksin terukur ppb x FP = 20,2 x 40 = 809,4 Lampiran 2. Gambar microplate yang digunakan dalam uji ELISA Lampiran 3. Microplate Spectrophotometer yang digunakan dalam uji ELISA Sampel Kadar aflatoksin terukur ppb Faktor Pengenceran FP Kadar aflatoksin ppb JCM A 27709 n.d - n.d B 29709 18,4 40 734,6 C 31709 13,9 40 556,7 D 3809 20,2 40 809,4 E 6809 11,1 40 445,9 54 Lampiran 4. Pertumbuhan isolat S.26 dalam media GAN termodifikasi Sampel S.26 Media GAN H-9 Sampel S.26 Media GAN H-12 Sampel S.26 Media GAN H-14 Sampel S.26 Media GAN H-16 Sampel S.26 Media GAN H-19 Sampel S.26 Media GAN H-21 55 Lampiran 5. Pertumbuhan isolat S.26 dalam media PDB Sampel S.26 Media PDB H-9 Sampel S.26 Media PDB H-12 Sampel S.26 Media PDB H-14 Sampel S.26 Media PDB H-16 Sampel S.26 Media PDB H-19 Sampel S.26 Media PDB H-21 56 Lampiran 6. Pertumbuhan isolat JCM dalam media GAN termodifikasi Sampel JCM Media GAN H-9 Sampel JCM Media GAN H-12 Sampel JCM Media GAN H-14 Sampel JCM Media GAN H-16 Sampel JCM Media GAN H-19 Sampel JCM Media GAN H-21 57 Lampiran 7. Pertumbuhan isolat JCM dalam media PDB Sampel JCM Media PDB H-9 Sampel JCM Media PDB H-12 Sampel JCM Media PDB H-14 Sampel JCM Media PDB H-16 Sampel JCM Media PDB H-19 Sampel JCM Media PDB H-21 58 Lampiran 8. Tabel Hasil Analisis dengan TLC pada media PDB Sampling Pembacaan TLC µL a Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Ulangan 4 Ulangan 5 Rataan + b S.26 c + b S.26 c + b S.26 c + b S.26 c + b S.26 c + b S.26 c H0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 H2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 H5 2 2 0,0 0,0 2 2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,8 0,8 H7 2 5 5 5 3 2 1 1 2 2 2,6 3 H9 3 9 6 10 4 4 4 4 3 3 4 5,8 H12 4 6 8 6 4 3 5 4 3 4 4,8 4,6 H14 4 2 5 4 4 3 2 2 3 2 3,6 2,6 H16 2 2 2 3 3 3 2 1 2 3 2,2 2,4 H19 0,0 2 1 3 2 1 1 1 2 2 1,2 1,6 H21 0,0 0,0 1 1 1 0,0 0,5 0,5 1 1 0,7 0,5 a Semua sampel dianalisis menggunakan standar 0,2 ppm, volume pengenceran 500 µL, dan volume spotting 2 µL. Contoh perhitungan: S.26 ulangan 1 H9 Diketahui: S = 9 µL Y = 0,2 µgmL V = 500 µL FP = 1 W = 1 mL Z = 2 µL Kandungan aflatoksin ppm = 9 µL x 0,2 µgmL x 500 µL x 1 1 mL x 2 µL = 0,450 µgmL = 0,450 ppm Kandungan aflatoksin = 450 ppb 59 Lampiran 9. Gambar peralatan TLC yang digunakan Lampiran 10. Gambar alat UV- reader dalam analisis TLC 60 Lampiran 11. Tabel Hasil Analisis HPLC pada media PDB Sampel Kadar Aflatoksin ppb Faktor Pengenceran Ulangan Jenis Sampel Kode Sampel B1 B2 G1 G2 Isolat S.26 H9 c HPLC 3 H9 44 1,1 --nd-- --nd-- 50 ULANG AN 2 Isolat JCM PDB + H7 7,4 -nd- --nd-- 0,1 50 PDB + H9 13,1 -nd- --nd-- 0,2 50 PDB + H12 16,9 0,4 --nd-- --nd-- 50 PDB + H14 8,9 0,2 --nd-- --nd-- 50 PDB + H16 14,9 -nd- --nd-- --nd-- 5 PDB + H19 0,0 --nd-- --nd-- --nd-- - PDB + H21 0,0 --nd-- --nd-- --nd-- - Isolat Aspergillusflavus lokal S.26 PDB H7 5,8 --nd-- --nd-- --nd-- 50 PDB H9 18,7 --nd-- --nd-- --nd-- 50 PDB H12 11,9 --nd-- --nd-- --nd-- 50 PDB H14 29,7 0,9 60,8 --nd-- 5 PDB H16 40,3 16,5 354,5 --nd-- 5 PDB H19 0,0 --nd-- --nd-- --nd-- - PDB H21 0,0 --nd-- --nd-- --nd-- - Contoh perhitungan: Sampel S.26 PDB H7 Diketahui: Ch = 5,8 ppb FP = 50 Bc = 1 mL Cp = 5,8 ppb x 50 1 mL = 290,2 ppb 61 Lampiran 12. Gambar kromatogram standar dalam analisis HPLC 62 Lampiran 13. Gambar kromatogram sampel dalam analisis HPLC 63 Lampiran 14. Sonikator yang digunakan dalam persiapan fase gerak HPLC Lampiran 15. Instrumen HPLC yang digunakan dalam analisis HPLC UJI POTENSI ISOLAT LOKAL Aspergillus flavus SEBAGAI PENGHASIL AFLATOKSIN SKRIPSI NICHO AFIANDI F24061661 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011 POTENTIAL TEST OF Aspergillus flavus LOCAL STRAIN AS AFLATOXIN PRODUCER Nicho Afiandi 1 , Hanifah Nuryani Lioe 1 , Romsyah Maryam 2 1 Department of Food Science and Technology, Faculty of Agricultural Engineering and Technology, Bogor Agricultural University, IPB Darmaga Campus, P.O. Box 220, Bogor 16002, West Java, Indonesia 2 Balai Besar Penelitian Veteriner, P.O. Box 151, Bogor 16114, West Java, Indonesia Phone 62 877 2017 4874, e-mail: mr.afiandihotmail.com ABSTRACT Aflatoxin is found in food and livestock feed in Indonesia. Aflatoxin is toxigenic, mutagenic, teratogenic, carcinogenic, and immunosuppresive compound. Hazardous potential of aflatoxin demands the avaibility of aflatoxin standard for analysis. Pure 55 strains of Aspergillus flavus were screened with ELISA to evaluate the potential yield of aflatoxin. Result of screening suggested that isolate S.26 contained the highest AFB1 1212,3 ppb. This isolate was chosen for aflatoxin production on PDB Potato Dextrose Broth media and GAN glucose ammonium nitrate media with five replications. A. flavus from JCM was also grown in the same media under the same condition as the reference isolate to produce aflatoxins. TLC analysis results suggested that both A. flavus cultures from S.26 and JCM isolates grown on GAN showed no ability to produce aflatoxin while those grown on PDB could produce aflatoxin. Aflatoxin analysis of the A. flavus culture of S.26 isolate grown on PDB by TLC suggested that the highest aflatoxin production was reached at the ninth until twelfth day with a range of aflatoxin concentrations 200-500 ppb and the average of 310 ppb n=5. Analysis of A. flavus culture of JCM isolate on PDB by TLC suggested that the highest aflatoxin production was reached at the twelfth day with a range of aflatoxin concentrations 150-400 ppb and the average of 240 ppb. HPLC analysis of A. flavus culture of S.26 isolate had the highest amount of aflatoxin of 935,8 ppb at the ninth day while A. flavus culture of JCM isolate had the highest aflatoxin production of 847,7 ppb at the twelfth day. A. flavus of local isolate S.26 has higher potential in producing aflatoxins on PDB media compared to A. flavus of reference isolate JCM. Production of alfatoxin might be affected by variations in nitrate source, initial pH, medium composition, and chain of serial transfers during preparation and analysis. The aflatoxin produced by A. flavus of local isolate in PDB media could be the candidate of aflatoxin standards which are essential for the analysis of aflatoxins by means of purification on column chromatography. Keywords:aflatoxin, Aspergillus flavus, HPLC, TLC, ELISA NICHO AFIANDI. F24061661. Uji Potensi Isolat lokal Aspergillus flavus Sebagai Penghasil Aflatoksin . Di bawahbimbinganHanifah Nuryani Lioe dan Romsyah Maryam. 2011. RINGKASAN Aflatoksin banyak ditemukan pada bahan pangan dan pakan yang berasal dari produk pertanian di Indonesia. Pengaruh aflatoksin terhadap keamanan pangan menjadi nyata terkait dengan kemampuannya untuk terakumulasi dalam bahan pangan.Aflatoksin merupakan senyawa toksigenik, mutagenik, teratogenik, karsinogenik, dan bersifat immunosuppresif.Potensi bahaya kontaminasi aflatoksin membutuhkan penanganan yang tepat dan terencana, termasuk penyediaan metode untuk menganalisis keberadaan aflatoksin dalam komoditas pertanian dengan cepat. Tujuan dari penelitian ini secara umum adalah menguji potensi isolat lokal Aspergillus flavusdalam menghasilkan aflatoksin yang dapat dijadikan kandidat standar acuan dalam analisis aflatoksin. Hal tersebut diharapkan mampu mengatasi masalah kekurangan persediaan standar acuan di berbagai laboratorium di Indonesia dalam melakukan analisis cemaran aflatoksin termasuk identifikasi dan kuantifikasi. Secara umum,penelitian ini terbagi atas tiga tahap. Tahap pertama berupa seleksi kemampuan isolat lokal Aspergillus flavus dalam menghasilkan aflatoksin menggunakan teknik ELISA. Tahap kedua berupa pembiakanisolatlokalA. flavusterpilih padamediaPDB Potato Dextrose Broth dan media GAN glucose ammonium nitrate termodifikasi. Tahap terakhir berupa analisis kandungan aflatoksin dalambiakanmenggunakan TLC Thin Layer Chromatography dan dikonfirmasi menggunakan HPLC High Performance Liquid Chromatography. Tahapseleksimenunjukkan bahwa dari 10 isolatlokal A. flavusyang terdiri atas 55 sampel yang diuji, isolat S.26 merupakan isolat Aspergillus flavus yang paling banyak memproduksi aflatoksin, terutama AFB1 sebesar 1212,3 ppb. Isolat tersebut kemudian dibiakkan dalam media PDB dan media GAN setelah disegarkanpada media agar miring SDA Sucrose Dextrose Agar. Tahappembiakan dilakukan selama tiga minggu dan dilakukan sampling pada interval waktu yang telah ditentukan. Pembiakan dilakukan menggunakan kontrol positif isolat Aspergillus flavus JCM. Tahapan analisis sampel dilakukan menggunakan TLC dan HPLC setelah sampel sebelumnya diekstrak menggunakan kloroform. Hasil analisis TLC menunjukkan bahwa sampel S.26 dan JCM yang dibiakkan dalam media GAN termodifikasi tidak menghasilkan aflatoksin. Sementara itu, hasil analisis TLCkedua isolatyang dibiakkan dalam media PDB secara konstan menghasilkan aflatoksin pada tiap ulangan n=5. Beberapa faktor yang diduga mempengaruhi perbedaan kemampuan produksi aflatoksin darikedua isolat tersebutdalam media PDB dan GAN antara lainadanyaperbedaan komposisi medium, pH awal dan sumber nitrat. Hasil analisis TLC untuk isolat S.26 dari media PDB menunjukkan produksi aflatoksin tertinggi pada hari 9-12 dengan kisaran konsentrasi 200-500 ppb dan rataan aflatoksin sebesar 310 ppb.Sementara itu, produksi aflatoksin tertinggi oleh isolat JCM pada media PDB terlihat pada hari ke-12 dengan kisaran konsentrasi yang lebih rendah yaitu150-400 ppb dan rataan sebesar 240 ppb. Aflatoksindari sampelbiakanA. flavusdalammedia PDB selanjutnyadikonfirmasimenggunakan HPLC setelah diderivatisasi menggunakanasamtrifluoroasetat TFA. Hasil analisis HPLC menunjukkan bahwa produksiaflatoksinolehisolat S.26 yang optimum terjadipadahari ke-9 dengankonsentrasisebesar 935,8 ppb. Sementara itu produksi aflatoksinolehisolat JCM yang optimum terjadipadahari ke-12 dengankonsentrasisebesar 847,7 ppb. Penurunan produksi aflatoksin yang optimum dibandingkan hasil uji ELISA disebabkan oleh adanya pengaruh dari faktor kesalahan positif yang dapat terjadi dalam uji ELISA. Berbagai faktor lain yang dapat mempengaruhi antara lainpenyegaran dalam media padat agar miring dan berbagai serial transfer dalam proses persiapan dan pembiakan. 1 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang