24 Kondisi pertumbuhan kemudian diatur pada suhu 25
o
C dengan tingkat kelembaban normal. Selanjutnya pertumbuhan pada kedua media cair tersebut diamati tren produksi
aflatoksin melalui pengamatan jumlah aflatoksin yang terdapat dalam medium. Pengamatan tren produksi aflatoksin dilakukan selama 21 hari dengan mengadakan
sampling pada interval waktu yang telah ditentukan seperti dapat dilihat pada Gambar 10.
H H
1 H 2 H 3 H
4 H
5 H
6 H
7 H
8 H 9 H 10 S1
S2 S3
S4 S5
H 11 H 12 H 13 H 14 H 15 H 16 H 17 H 18 H 19 H 20 H 21
S6 S7
S8 S9
S10
Gambar 10. Interval sampling yang dilakukan S1-S10 dari total 21 hari inkubasi H0-H21 Hasil sampling kemudian dianalisis dengan metode TLC untuk melihat total aflatoksin
dalam media sebagai hasil metabolisme sekunder Aspergillus flavus. yang ditumbuhkan pada media. Total aflatoksin dari hasil sampling kemudian digambarkan dalam bentuk
kurva produksi aflatoksin untuk memperoleh informasi saat produksi maksimum aflatoksin tercapai. Setelah produksi aflatoksin mencapai maksimum, media dengan nilai
produksi maksimum tertinggi akan dipanen untuk selanjutnya dilakukan tahapan produksi massal.
C. Analisis
1. Seleksi Isolat Lokal Menggunakan KIT ELISA Aflatoksin Produksi
Bbalitvet
a. Preparasi Ekstrak Sampel
Metode analisis yang digunakan yaitu metode ELISA kompetitif langsung
Rachmawati 2005; Rachmawati et al. 2004. Sebanyak 1 mL sampel cair yang terdiri
atas 55 sampel isolat lokal Aspergillus flavus yang telah ditumbuhkan pada media PDB inkubasi 9 hari pada suhu 25° dipipet ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan
klorofom sebanyak 1 mL dan divorteks selama 1 menit. Fase klorofom kemudian diambil dan dimasukkan ke dalam botol sampel. Kemudian ditambahkan lagi 1 mL klorofom
pada larutan yang tersisa di dalam tabung untuk kemudian divorteks selama 1 menit. Fase klorofom diambil dan dimasukkan ke dalam botol sampel.
25 Klorofom dalam botol sampel kemudian dikeringkan dalam water bath. Selanjutnya
ditambahkan metanol 60 sebanyak 1 mL pada sampel dalam botol sampel dan dikocok hingga aflatoksin terlarut dalam metanol 60. Larutan yang dihasilkan kemudian diambil
untuk dianalisis dengan cara di bawah.
b. Preparasi Konjugat Encer
Konjugat aflatoksin peroksidase AFB1-HRPO dicampur dengan pengencer konjugat dalam perbandingan 30 l konjugat per mL pengencer konjugat. Konjugat yang
telah dibuat kemudian disiapkan untuk dicampurkan dengan standar dalam plat pencampuran.
c. Preparasi larutan Substrat
Substrat A buffer natrium asetat dalam ELISA-Kit Aflavet dicampur dengan substrat B tetramethilbenzidine dalam perbandingan 30 l substrat B per mL substrat A.
Substrat yang telah siap kemudian digunakan dalam proses pencampuran.
d. Analisis Aflatoksin B1 dengan KIT ELISA
1.
Tahap Pencampuran dalam microplate
Sebelum pencampuran semua bahan terlebih dahulu dikondisikan dalam suhu ruang. Larutan standar aflatoksin B1 AFB1 dengan konsentrasi 0,12; 0,37; 1,10;
3,30; 10,00; dan 30,00 ppb disiapkan. Kemudian dalam plat pencampuran dibuat campuran antara 100 l standar AFB1 dan 100 l konjugat yang telah diencerkan.
Blanko juga dibuat dengan mencampurkan 100 l metanol 60 dengan 100 l metanol 60.
2.
Tahap reaksi
Campuran standar atau ekstrak sampel dan konjugat pada plat pencampuran kemudian dipindahkan sebanyak 75 l ke dalam plat terlapis antibodi masing-masing
duplo. Campuran pada plat terlapis antibodi kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 5 menit. Selanjutnya larutan dibuang dan plat dicuci dengan 3 kali pencucian
dalam air kemudian dikeringkan. Pada plat terlapis antibodi kemudian ditambahkan larutan substrat yang sudah disiapkan sebanyak 100 l dan plat diinkubasikan kembali
selama 10 menit dalam suhu ruang
.
Pada tahap ini akan terbentuk warna hijau yang kepekatannya berbanding terbalik dengan konsentrasi aflatoksin yang terdeteksi pada plat. Tahap selanjutnya
ialah penambahan 50 l larutan penghenti H
2
SO
4
1,25 M hingga warna larutan pada plat terlapis antibodi berubah menjadi kuning dan siap untuk dibaca pada ELISA
reader microplate spectrophotometer. Ilustrasi pada plat terlapis antibodi dapat
dilihat pada Gambar 11 Catatan: A1=campuran baris A kolom 1 pada plat pencampur.
26
1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 9’ 10’ 11’ 12’ A’
A1 A1
A2 A2
B’ B1
B1 B2
B2 C’
C1 C1
C2 C2
D’ D1
D1 D2
D2 E’
E1 E1
E2 E2
F’ F1
F1 F2
F2 G’
G1 G1
G2 G2
H’ H1
H1 H2
H2
Gambar 11. Ilustrasi pada antibody-coated microplates
3.
Tahap Pembacaan dan Perhitungan
Larutan pada plat terlapis antibodi dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm. Pembacaan dengan ELISA reader akan mendapatkan nilai
serapan warna optical density pada tiap sumur plat. Perhitungan dilakukan dengan menggunakan persamaan yang telah tersedia pada program penunjang. Data
kandungan AFB1 pada sampel diperoleh dengan memasukkan hasil pengukuran OD atau persen inhibisi sampel ke persamaan garis kurva kalibrasi standar, dikalikan
faktor pengenceran dan dibagi bobot sampel. Apabila inhibisi sampel yang diperoleh lebih besar dari persen inhibisi standar 10-30 ppb, terdapat kemungkinan
sampel mengandung AFB1 dalam jumlah tinggi sehingga diperlukan perlakuan pengenceran untuk mendapat kisaran konsentrasi yang terdeteksi pada ELISA-Kit.
Konsentrasi akhir kemudian harus dikalikan lagi dengan faktor pengenceran.
2. Analisis Produksi Aflatoksin Bainton et al. 1980
27
a.
Sampling
Proses sampling dilakukan dengan mengambil 1 mL media secara aseptis dan kemudian disimpan pada botol sampel yang telah disiapkan
.
b. Ekstraksi Aflatoksin
