Penyegaran Isolat Sampel Hasil Seleksi Evaluasi Pertumbuhan Isolat dalam Media Cair dan Produksi

22

A. Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah Aspergillus sp. isolat lokal yang dikumpulkan dari berbagai daerah disekitar Jawa Barat dan Jabotabek, isolat Aspergillus sp. JCM, standar aflatoksin B1 AFB1, metanol 60, pengencer konjugat, konjugat aflatoksin peroksidase AFB1-HRPO, tetramethilbenzidine TMB, buffer natrium asetat, media agar miring SDA Sucrose Dextrose Agar, media PDB Potato Dextrose Broth, asam klorida HCl 1 M, natrium hidroksida NaOH 1 M, media GAN Glucose Ammonium Nitrate, kloroform, akuades, akuades steril, asam sulfat H2SO4 1,25M, glukosa, ammonium nitrat, kalium dihidrogen fosfat, magnesium sulfat, suplemen mineral, timbal asetat, asam asetat glasial, akuabides, alkohol 85, metanol, n-heksana, dan trifluoroasetat TFA. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian antara lain botol sampel, ELISA-kit Aflavet mencakup mixing plate, antibody-coated plate dan, botol konjugat, microplate spectrophotometer , pipet 100 l, pipet 200 l, multi-channel pipette, tip, timer, bak cuci, komputer, printer, erlenmeyer pyrex ® iwaki te-32 250 ml , tabung reaksi, pipet Boeco C000267 1 mL, sarung tangan lateks, masker wajah, freezer, inkubator, beberapa mikroskop Olympus mikroskop inversi cx-41rf class:student microscope; Vickers mikroskop binokular M. 750294 , hemasitometer Marienfeld assistent No. 422, vorteks, pembakar bunsen, kapas tutup erlemenyer, alumunium foil, oven Memmert tv50b; Bindered 53, autoklaf All American1941x, kulkas Sanyo SR-258FG frost type, TLC-plates, TLC-reader, dan laminary air flow cabinet Oliphant VLF4LUS S198, dan HPLC Hitachi D-7000 HSM: Interface D- 7000, FL-Detector L-7485, Autosampler L-7200, UV-detector L-7400.

B. Metode

1. Seleksi Isolat Lokal Aspergillus sp yang Berpotensi Memproduksi

Aflatoksin Uji potensi isolat menggunakan kit ELISA yang dikembangkan oleh Rachmawati et al. 2005. Sebanyak 10 isolat lokal yang terdiri dari 55 sampel yang telah diisolasi dari biji jagung, kacang tanah tanpa kulit, dan pakan ternak dari beberapa daerah di Jabodetabek ditumbuhkan pada media PDB inkubasi 9 hari, suhu 25°C. Sampel-sampel tersebut kemudian diuji potensinya untuk memproduksi aflatoksin menggunakan teknik ELISA. Seleksi dilakukan dengan jumlah produksi aflatoksin B1 sebagai kriteria seleksi. Sampel dengan hasil produksi aflatoksin B1 tertinggi akan dipilih untuk evaluasi pada tahap berikutnya.

2. Evaluasi Produksi Aflatoksin pada Dua Medium Cair

a. Penyegaran Isolat Sampel Hasil Seleksi

23 Penyegaran isolat dilakukan untuk persiapan pembuatan suspensi isolat dalam media cair sebagai persiapan untuk tahap pembiakan isolat lokal hasil seleksi dalam media cair. Isolat lokal Aspergillus flavus dari sampel cair hasil seleksi disegarkan kembali dengan cara ditumbuhkan pada media agar miring SDA Sucrose Dextrose Agar selama satu minggu pada suhu 25°C. Koloni yang tumbuh kemudian disuspensikan untuk memperoleh suspensi Aspergillus sp sebanyak 10 9 sporamL. Suspensi yang diperoleh kemudian diinokulasikan pada media cair yang telah disiapkan seperti yang dijelaskan di bawah.

b. Evaluasi Pertumbuhan Isolat dalam Media Cair dan Produksi

Aflatoksin Evaluasi dilakukan terhadap isolat hasil penyegaran untuk melihat kurva produksi aflatoksin dan jumlah produksi aflatoksin dengan ilustrasi percobaan yang dapat dilihat pada Gambar 9. Suspensi Aspergillus sp. Sebanyak 10 9 sporamL yang telah disiapkan dari hasil penyegaran isolat diinokulasikan sebanyak 1,5 mL pada erlemenyer yang berisi 150 mL media cair sehingga diperoleh 10 7 sporamL pada media yang siap untuk ditumbuhkan. Adapun media cair yang digunakan dalam penelitian ini ialah: I. Media Potato dextrose broth PDB dengan pengaturan pH pada kisaran pH 4,00 Kusumaningtyas 2007. II. Medium GAN glucose ammonium nitrate mengikuti Brian et al. 1961 termodifikasi yang terdiri atas 30 g glukosa, 30 g sukrosa, 2,4 g NH 4 NO 3 , 10,0 g KH 2 PO 4 , 2,0 g MgSO 4 .7H 2 O, dan suplemen mineral mencakup 26,6 mg ZnSO 4 .7H 2 O, 2,67 mg CuSO 4 .5H 2 O, 1,36 mg CoNO 3 2 .6H 2 O dan 66,67 mg CaCl 2 dengan pH 7,00. Gambar 9. Ilustrasi Percobaan dengan menggunakan isolat S.26 s dari dua media berbeda PDB dan GAN dalam lima ulangan dengan kontrol negatif - yakni media yang tidak diinokulasi dan kontrol positif + berupa media yang diinokulasi isolat JCM. s + ‐ s + ‐ PDB GAN 24 Kondisi pertumbuhan kemudian diatur pada suhu 25 o C dengan tingkat kelembaban normal. Selanjutnya pertumbuhan pada kedua media cair tersebut diamati tren produksi aflatoksin melalui pengamatan jumlah aflatoksin yang terdapat dalam medium. Pengamatan tren produksi aflatoksin dilakukan selama 21 hari dengan mengadakan sampling pada interval waktu yang telah ditentukan seperti dapat dilihat pada Gambar 10. H H 1 H 2 H 3 H 4 H 5 H 6 H 7 H 8 H 9 H 10 S1 S2 S3 S4 S5 H 11 H 12 H 13 H 14 H 15 H 16 H 17 H 18 H 19 H 20 H 21 S6 S7 S8 S9 S10 Gambar 10. Interval sampling yang dilakukan S1-S10 dari total 21 hari inkubasi H0-H21 Hasil sampling kemudian dianalisis dengan metode TLC untuk melihat total aflatoksin dalam media sebagai hasil metabolisme sekunder Aspergillus flavus. yang ditumbuhkan pada media. Total aflatoksin dari hasil sampling kemudian digambarkan dalam bentuk kurva produksi aflatoksin untuk memperoleh informasi saat produksi maksimum aflatoksin tercapai. Setelah produksi aflatoksin mencapai maksimum, media dengan nilai produksi maksimum tertinggi akan dipanen untuk selanjutnya dilakukan tahapan produksi massal.

C. Analisis