Sehingga, dosis yang yang digunakan adalah 23g70Kg BB untuk konversi manusia 70 kg ke tikus 200 g = 0,018 Laurence and Bacharach, 1964.
Dosis untuk 200g tikus = 0,018 x 23g = 0,414g200g BB
= 2,07x10
-3
gg BB = 2,07 gKg BB
Dalam penelitian ini dibuat 3 peringkat dosis, dengan cara menggunakan kelipatannya. Angka kelipatan yang digunakan sebesar satu setengah kalinya,
sehingga diperoleh tiga peringkat dosis yaitu 1,38 ; 2,07 ; 3,105 gkgBB.
6. Penetapan dosis aquadest sebagai kontrol negatif
Untuk penentuan dosis aquadest digunakan dosis tertinggi untuk mengetahui jumlah volume maksimum yang diberikan kepada hewan uji. Dosis
tertinggi 3,105 gkgBB, berdasarkan rumus didapatkan volume maksimum yaitu : D x BB = C x V
3,105gKg BB x 200g = 20 x V V = 3,105 ml200g BB
Maka dosis aquadest adalah : V = 0,015525 mlg BB
V = 0,015525 gg BB karena 1ml aquadest sama dengan 1g V = 15,525 gKg BB
7. Pembutan infusa daun sirih merah
Sebanyak 20 g daun sirih merah direbus selama 15 menit dengan 100 ml akuadest, pada suhu 90
C sambil sesekali diaduk. Setelah dingin, Larutan disaring
dan di tambahkan volumenya dengan akuadest hingga 100 ml. Konsentrasi infusa
yang didapat adalah 20. 8.
Penyiapan hewan uji
Hewan uji yang digunakan terdiri dari tikus jantan dan betina, galur Wistar, umur 2- 3 bulan, berat badan 100 – 200 g, berjumlah 40 ekor 20 jantan
dan 20 betina disiapkan dan ditempatkan dalam metabolic cage. Pada setiap metabolic cage berisi satu tikus. Tiga hari sebelum dilakukan perlakuan hewan uji
diadaptasikan pada metabolic cage.
9. Pengelompokan hewan uji
Pada penelitian ini digunakan empat puluh ekor tikus, dibagi menjadi empat kelompok secara acak, yaitu satu kelompok kontrol dan tiga kelompok
perlakuan, masing-masing kelompok uji terdiri dari sepuluh ekor tikus lima jantan dan lima betina. Kelompok II sampai IV diberi perlakuan infusa daun sirih
merah dengan peringkat dosis berturut-turut, yaitu 1,38 ; 2,07 ; 3,105 gkgBB tikus. Kelompok I, yaitu kelompok kontrol negatif diberi aquadest dengan dosis
15,525 gKg BB.
10. Prosedur pelaksanaan toksisitas subkronis
Sediaan uji berupa infusa daun sirih merah diberikan pada hewan uji sesuai dosis pemberian dengan kekerapan pemberian satu kali sehari selama 28
hari pada tikus jantan dan betina dengan tetap diberi makan dan minum. Pada awal masa uji, yaitu pada hari ke-1, darah semua tikus diambil melalui sinus
orbital mata, ditampung pada effendorf berisi heparin untuk diambil serum darah kemudian dilakukan pengukuran kadar SGPT darah tikus. Pengukuran kadar
SGPT darah dilakukan di Parahita Medical Lab. Pemberian infusa daun sirih merah dilakukan selama 28 hari pada setiap kelompok perlakuan sesuai dengan
peringkat dosis. Pada hari ke-29 darah semua tikus diambil melalui vena orbital mata, ditampung pada effendorf berisi heparin untuk diambil serum darah
kemudian dilakukan pengukuran kadar SGPT darah tikus. Pada hari ke-29 juga dilakukan pembedahan setengah dari hewan uji baik jantan maupun betina.
Sebelum pembedahan, hewan uji dikorbankan dengan cara cervical dislocation dislokasi leher. Dislokasi leher adalah cara mematikan hewan uji dengan cara
menarik leher dan ekor secara bersamaan sehingga tulang leher patah. Kemudian
pada hari ke-42 14 hari setelah 28 dilakukan pembedahan hewan uji yang tersisa untuk melihat reversibilitas.
11. Prosedur pembedahan
Pertama-tama disiapkan pot organ yang yag telah diberi label dan yang sesuai dengan nomor tikus yang akan dibedah dan telah diisi dengan formalin
10 untuk menyimpan organ. Kemudian, menyiapkan alat-alat bedah yang akan digunakan gunting bedah, pinset, papan bedah, pins, beker gelas. Beker gelas
digunakan untuk menampung NaCl 0,9 mencuci organ setelah dibedah. Setelah itu, tikus yang akan dibedah di dislokasi leher terlebih dahulu kemudian posisikan
tikus pada papan bedah menggunakan pins. Bedah dimulai dari bagian perut sampai bagian leher menggunakan gunting bedah. Kemudian, ambil dan pisahkan
masing-masing organ menggunakan gunting bedah dengan bantuan pinset, pastikan tiap-tiap organ tidak tercampur, kemudian organ tersebut dicuci dengan
NaCl 0,9 kemudian dimasukkan ke dalam pot organ yang sesuai antara label
